[发明专利]特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。所述体外特异性探针的结构式如下所示当Rsubgt;1/subgt;为时，所述体外特异性探针的结构式为记为CL‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑A特异性结合；Rsubgt;1/subgt;为时，所述体外特异性探针的结构式为记为PA‑TCO，所述体外特异性探针与MAO‑B特异性结合。特异性探针的反式环辛烯结构通过与带有1,2,4,5‑四嗪衍生物结构的染料发生生物正交反应，产物会产生强的荧光，再通过荧光变化测定不同生物体系中单胺氧化酶A/B的活性。该探针以全化学合成的方法制备，原料廉价易得，制备过程简单容易合成，能够特异性识别蛋白、检测速度快，用于体外半定量分型检测单胺氧化酶。

技术领域

本发明属于有机/生物化学领域，具体涉及特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质对所有生物体都是必不可少的物质，可以用作健康状况和疾病状态的重要生物标记，快速检测蛋白质对疾病的诊断和治疗至关重要。如今常用于检测蛋白质水平表达的方法是蛋白质免疫印迹法，这是一种用特异性抗体检测某特定抗原的蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。该检测方法存在很多弊端，如抗体孵育时间长，抗体成本高，操作过程繁杂。现有其他检测蛋白的方法有免疫荧光法，液相色谱与质谱，酶联免疫吸附测定等，这些方法仍然摆脱不了抗体，需要价格昂贵的仪器和专业的技术人员，并且难以实现定量检测等。因此，亟需开发低成本、高通量、高特异性、少用甚至无需抗体的蛋白质检测方法，用以分析复杂样本中的蛋白质。

单胺氧化酶(MAOs)是一种表达在线粒体外膜上的蛋白，根据其对天然底物或探针结合的特异性和细胞分布等不同，MAOs分为两种亚型——MAO-A和MAO-B，异常表达的MAO-A或MAO-B均会引起神经退行性疾病和紊乱，如人体内MAO-A的过度表达与精神分裂症和抑郁症有着重要联系，MAO-B在帕金森病和阿兹海默症患者大脑中大量表达。然而，MAO-A和MAO-B高度同源，基因相似程度高达90％，活性氨基酸序列相似率高达70％，二者难以区分。因此，亟待开发特异性的区分方法，从基因层面实现对神经退行性疾病的分型与早期预诊。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针及其制备方法与应用。探针以全化学合成的制备方法颠覆性取缔了传统检测中的抗体的孵育和应用，原料易得，制备过程简单，后续的检测过程无需繁琐的操作，能够特异性识别单胺氧化酶。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

特异性分检单胺氧化酶的活性小分子探针，其结构式如下所示其中R₁为

作为改进的是，当R1为时，所述体外特异性探针的结构式为，记为CL-TCO，所述体外特异性探针与MAO-A特异性结合；R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为PA-TCO，所述体外特异性探针与MAO-B特异性结合。

上述体外特异性探针的制备方法，当R1为时，所述体外特异性探针的结构式为记为CL-TCO，具体的制备方法如下：

第一步：2-氯-4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚的合成过程所需反应时间为4-10h；第二步：叔丁基(2-氯-4-甲基苯氧基)二甲基硅烷的合成过程加热回流时间为2-8h；第三步：(4-(溴甲基)-2-氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为5-10h；第四步：(E)-叔丁基(2-氯-4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为2-10h；第五步：(E)-N-(3-(2-氯-4-((环辛-4-烯-1-氧基)甲基)苯氧基)丙基)-N-甲基丙-2-炔-1-胺的合成过程将(E)-2-氯-4-((环辛-4-烯-1-丙氧基)甲基)苯酚、1,3-二溴丙烷溶于乙腈，加入碳酸钾，在氮气保护下回流2-4h，冷却至室温后加入N-甲基丙-2-胺，和碳酸钾在40±10℃条件下搅拌22-48h；