[发明专利]一种基于启动子构建文库的方法及其文库在审
| 申请号： | 202210161966.8 | 申请日： | 2022-02-22 |
| 公开（公告）号： | CN114411266A | 公开（公告）日： | 2022-04-29 |
| 发明（设计）人： | 王娟;唐冲 | 申请（专利权）人： | 深圳华大基因股份有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C40B40/06;C12Q1/6806;C12Q1/6869 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 周建军;彭家恩 |
| 地址： | 518083 广东省深圳市盐田*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 启动子 构建 文库 方法 及其 | ||
1.一种基于启动子构建文库的方法，包括：
打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；
酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化，使非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；
T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；
体外转录步骤，包括将所述连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；
反转录及扩增步骤，包括对所述RNA进行反转录、PCR扩增，获得所述文库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7启动子连接步骤中，退火反应条件如下：95～98℃，1～3min；55～65℃，1～3min；25～40℃，1～5min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7启动子连接步骤中，退火结束后，将退火后的待测样本与dNTP以及DNA聚合酶混合反应，得到反应后的待测样本。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将退火后的待测样本与dNTP以及DNA聚合酶混合反应时，反应条件如下：30～37℃，15～25min；65～75℃，10～20min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，T7启动子连接步骤结束后，不进行纯化，直接进行体外转录。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，打断步骤中，使用酶对待测样本进行打断；
优选地，所述酶包括Tn5转座酶；
优选地，所述酶包埋有生物素修饰的接头；
优选地，打断步骤中，打断处理后，加入补平反应液，反应得到补平缺口后的待测样本；
优选地，打断步骤中，补平缺口后，使用磁珠对待测样本进行纯化。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，酶促甲基化转化步骤中，使用加氧酶氧化待测样本中的DNA，然后使用脱氨酶进行脱氨，反应得到脱氨后的待测样本；
优选地，所述加氧酶包括TET酶；
优选地，所述TET酶包括TET1酶、TET2酶、TET3酶中的至少一种；
优选地，所述脱氨酶包括APOBEC酶；
优选地，体外转录步骤中，使用T7 RNA聚合酶将所述连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；
优选地，打断步骤中，所述待测样本包括基因组DNA样本、游离DNA样本中的至少一种；
优选地，打断步骤中，所述待测样本的核酸分子中含有5-甲基胞嘧啶；
优选地，打断步骤中，所述待测样本的起始量≤100pg；
优选地，打断步骤中，所述待测样本的起始量为20～100pg。
8.如权利要求1～7任意一项所述方法构建得到的文库。
9.由权利要求8所述的文库上机测序所获得的测序数据。
10.如权利要求9所述的测序数据，其特征在于，所述测序数据的测序深度≤3×；
优选地，所述测序数据的测序深度≤2×。
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