[发明专利]一种基于启动子构建文库的方法及其文库

说明书

一种基于启动子构建文库的方法及其文库。该方法包括：打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化；T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；体外转录步骤，包括将连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；反转录及扩增步骤，包括对RNA进行反转录、PCR扩增，获得文库。相比于现有技术中直接做PCR，本发明中T7的转录(针对富含尿嘧啶的DNA)更加均一，转录能获得较多的RNA作为下一步cDNA扩增的模板，极大地提升了甲基化的覆盖度。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种基于启动子构建文库的方法及其文库。

背景技术

近年来，单细胞测序技术的快速发展为复杂的生物系统提供了许多有价值的见解，例如，揭示复杂和罕见的细胞群体，跟踪不同细胞谱系的发展轨迹。目前有许多单细胞测序方法，其中最流行的是常规的单细胞RNA或DNA测序。除了RNA和DNA信息外，表观遗传修饰是指在不改变DNA序列本身的情况下，在遗传物质中引起可遗传表型的变化。在这些表观遗传修饰中，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)是脊椎动物中最丰富的修饰基，已成为调控胚胎发育、基因组印迹、X失活、细胞分化和增殖的重要研究课题。

目前主要针对5mC的单细胞测序技术，从策略上主要分为：1、传统的先建库后亚硫酸氢盐处理(Pre-BS)；2、亚硫酸氢盐处理后再建库(post-bisulfite adaptor tagging，PBAT)。基于PBAT策略的技术，有以下几种：scBS-seq、scWGBS、snmC-seq(基于单细胞核的DNA甲基化测序研究)。其中Smallwood的scBS-seq技术检测到位点数最多，能检测到3700万个CpG位点。此外，最近的进展促进了高通量的单细胞甲基化测序。甲基化分析的单细胞组合索引(sci-MET)使用带索引的转座子标记单细胞，然后在亚硫酸氢盐转换后随机启动标记另一个接头。虽然这些方法提高了接头的连接效率，但在亚硫酸氢盐的严酷处理中，它们都存在DNA降解的问题。最近报道了一种温和的转化方法TAPS，利用高浓度的TET1将5mC转化为5CaC，再用碳酸氢盐将5CaC转化为尿嘧啶。然而，这种TET1并不适用于大多数实验室。综上所述，单细胞甲基化测序的覆盖率较低，仅达到20％的CpG，不到10％的基因组。这就需要提高单细胞的覆盖范围和准确性、读取长度。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种基于启动子构建文库的方法，包括：

打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；

酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化，使非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；

体外转录步骤，包括将所述连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；

反转录及扩增步骤，包括对所述RNA进行反转录、PCR扩增，获得文库，即为可用于上机测序的文库。

根据第二方面，提供第一方面所述方法构建得到的文库。

根据第三方面，在一实施例中，提供由第二方面所述的文库上机测序所获得的测序数据。

依据上述实施例的一种基于启动子构建文库的方法及其文库，相比于现有技术中直接做PCR，本发明中T7的转录(针对富含尿嘧啶的DNA)更加均一，转录能获得较多的RNA作为下一步cDNA扩增的模板，更均一地获得了大量的DNA模板，极大地提升了甲基化的覆盖度。

附图说明

图1为实施例1的建库流程示意图。

图2为T7体外转录后的RNA片段测试结果图。