[发明专利]一种构建原位肝癌动物模型的方法

说明书

本发明公开了一种构建原位肝癌动物模型的方法，属于动物模型领域。本发明通过筛选得到靶向AXIN1基因、PTEN基因和TP53基因并具有较好编辑能力的sgRNA，其中，特异性靶向AXIN1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3所示，特异性靶向PTEN基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6所示以及特异性靶向TP53基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7‑9所示；将sgRNA通过串联基因编辑技术，注射到动物肝脏中构建原位肝癌动物模型。通过实验验证，发现将2‑3个上述抑癌基因组合构建的敲除模型，3‑4个月时已明显成瘤，成瘤率最高可达100％。

技术领域

本发明涉及动物模型领域，特别是涉及一种构建原位肝癌动物模型的方法。

背景技术

生物医药产业一直是国家重点发展的战略性新兴产业，支撑生物医药产业的发展离不开医学、药学的创新性前沿性基础科学研究，而作为“人类的替身”疾病动物模型，是研究疾病生物学特性、发病机理、药物筛选和疾病治疗的重要实验工具，可以说没有实验动物，就没有今天生物医学的发展和进步。在肝癌疾病研究方面，目前的试验肝癌动物模型仍存在诸多不足：(1)化学药物诱导模型存在的造模时间长达1年多，造模病死率高等缺陷；(2)皮下细胞移植瘤模型不能模拟临床肿瘤生长的环境；(3)原位种植瘤模型种植过程繁琐、技术要求高，另外种植模型多采用免疫缺陷鼠，不适合设计用于免疫系统的研究。因此，探索和建立更多能模拟临床肿瘤发生发展，易于获取且经济有效的肿瘤试验动物模型类型是未来发展方向。

基因工程编辑技术能精确靶向目的基因的敲除和插入，诱导肿瘤发生的基因背景清晰，有利于从遗传基因层面、时间空间层面阐明肝癌致病机理，有利于研究肿瘤微环境与基因突变交互作用对肿瘤发生发展的影响。目前国内及国外已有文献报道采用基因工程技术成功构建了小鼠肝癌动物模型，但是目前报道采用的基因主要有P53与PTEN基因联合敲除或增加过表达Myc基因等。而单用这几个基因编辑产生的动物模型品种单一，而且成瘤时间一般要6月以上，难以满足不同研究者探索不同基因编辑背景引发动物肿瘤研究的需求。因此，寻求一种构建肝癌动物模型的新方法对于解决现有肝癌动物模型所存在的缺陷非常关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建原位肝癌动物模型的方法，以解决上述现有技术存在的问题，能在3-4个月内完成肝癌动物模型的构建，并且成瘤率可高达100％，能明显缩短建模时间和提高成瘤率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种sgRNA，其包括如SEQ ID NO：1-3所示的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA，如SEQ ID NO：4-6所示的特异性靶向PTEN基因的sgRNA以及如SEQ ID NO：7-9所示的特异性靶向TP53基因的sgRNA。

本发明还提供一种同时靶向敲除AXIN1基因和PTEN基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA和特异性靶向PTEN基因的sgRNA。

本发明还提供一种同时靶向敲除AXIN1基因和TP53基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述的特异性靶向AXIN1基因的sgRNA和特异性靶向TP53基因的sgRNA。

本发明还提供一种同时靶向敲除PTEN基因和TP53基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述的特异性靶向PTEN基因的sgRNA和特异性靶向TP53基因的sgRNA。

本发明还提供一种同时靶向敲除PTEN基因、TP53基因和AXIN1基因的CRISPR/Cas9系统，包括所述的特异性靶向PTEN基因的sgRNA、特异性靶向TP53基因的sgRNA和特异性靶向AXIN1基因的sgRNA。

本发明还提供一种利用所述的CRISPR/Cas9系统构建原位肝癌动物模型的方法，包括如下步骤：