[发明专利]一种生产2-KLG的葡萄糖酸杆菌一步菌底盘细胞库的构建方法

说明书

本发明公开了一种生产2‑KLG的葡萄糖酸杆菌一步菌底盘细胞库的构建方法，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过对含有SNDHSDH的G.cerinus CGMCC 1.110与G.oxydans WSH‑004进行蛋白组分析，并对葡萄糖酸杆菌WSH‑003、CGMCC 1.49、CGMCC 1.110中SNDHSDH的功能验证，鉴定了SNDHSDH表达量低是多数葡萄糖酸杆菌不产2‑KLG的关键因素，进而通过过表达葡萄糖酸杆菌内源SNDHSDH构建了丰富的一步合成2‑KLG的底盘细胞库，为后续构建高产2‑KLG的葡萄糖酸杆菌提供了可选择的底盘细胞。

技术领域

本发明涉及一种生产2-KLG的葡萄糖酸杆菌一步菌底盘细胞库的构建方法，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)是一种好氧、杆状革兰氏阴性菌，因其卓越的糖醇不完全氧化能力，在维生素C、二羟基丙酮、米格列醇等诸多产品生产中发挥着重要作用。氧化葡萄糖酸杆菌非凡的底物转化能力主要依赖于其细胞膜上或胞内众多高活性的脱氢酶。在生产维生素C前体2-KLG的催化过程中，葡萄糖酸杆菌一步菌可使底物山梨醇经膜绑定的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖的山梨醇脱氢酶(SLDH)高效的转化为山梨糖，然后利用膜绑定的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的山梨糖脱氢酶(SDH)将山梨糖转化为山梨酮，最后利用胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)依赖的山梨酮脱氢酶(SNDH)将山梨酮转化为2-KLG。

葡萄糖酸杆菌一步菌是实现维生素C一菌一步生产的最具前景的底盘细胞之一。前期葡萄糖酸杆菌一步菌的获得主要依赖于从自然界或者菌株突变文库中筛选，工作量极大。本发明通过生物信息学分析发现许多野生型葡萄糖酸杆菌基因组上均含有山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶(SNDHSDH)核苷酸序列，但是发酵后却并不能产生2-KLG，随后结合蛋白组学分析和基因工程手段，构建了葡萄糖酸杆菌一步菌库，为后续构建高产2-KLG的葡萄糖酸杆菌一步菌提供了较多的可选择的底盘细胞。

发明内容

本发明以商业化质粒pBBRMCS5为表达载体，对葡萄糖酸杆菌内源SNDHSDH基因簇进行过量表达，以提供一种可以以山梨醇为底物一步合成2-KLG的重组葡萄糖酸杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种重组葡萄糖酸杆菌，所述重组葡萄糖酸杆菌是以葡萄糖酸杆菌为出发菌株，过表达了葡萄糖酸杆菌来源的山梨酮脱氢酶和山梨糖脱氢酶。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶的和山梨糖脱氢酶来源于G.oxydans WSH-004，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶的和山梨糖脱氢酶来源于G.cerinusCGMCC 1.110，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶的和山梨糖脱氢酶来源于G.japonicusCGMCC 1.49，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶的和山梨糖脱氢酶来源于G.oxydans WSH-003，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

在一种实施方式中，所述重组葡萄糖酸杆菌以葡萄糖酸杆菌为出发菌株，过表达了内源SNDHSDH基因簇。