[发明专利]一种基于核酶-CRISPR的食品铅污染检测方法

权利要求书

1.一种向导RNA(gRNA)转录溶液，包括：

100nM gRNA模板；

100nM T7启动子；

1X Phi29缓冲液；

0.1U/μL Phi29 DNA聚合酶；

200nM dNTPs；

1X转录缓冲液；

0.1U/μL RNA聚合酶；

200nM rNTPs；

0.05U/μL DNase I(RNase-free)；

1X DNase Ibuffer；以及

分子生物水；

将上述溶液涡旋混匀后，置于金属浴37℃条件下过夜转录。

2.根据权利要求1所述的向导RNA(gRNA)转录溶液，其中：

所述gRNA模板，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述T7启动子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

所述Phi29缓冲液组成为60mM Tris-SO₄(pH9.0@25℃)，20mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，3％甘油和0.05％Tween-20；

所述Phi29 DNA聚合酶是人工纯化的枯草芽孢杆菌噬菌体phi29(Φ29)的复制聚合酶；

所述dNTPs为脱氧核糖核酸A、T、C、G的混合溶液；

所述转录缓冲液组成为400mM Tris-HCl(25℃，pH 8.0)，200mM MgCl₂，25mM TCEP，20mMspermidine；

所述RNA聚合酶为一种依赖特异性DNA的RNA聚合酶，识别噬菌体的T7启动子序列；

所述rNTPs为核糖核酸A、U、C、G的混合溶液；

所述DNase I(RNase-free)是一种降解双链和单链DNA的DNA特异性核酸内切酶，降解产物为具有5'-磷酸和3'-OH的短寡核苷酸；

所述DNase Ibuffer组成为10mM Tris-HCl，2.5mM MgCl₂，0.5mM CaCl₂，pH 7.6@25℃

所述转录溶液用分子生物水补齐至40μL。

3.一种铅离子待检溶液，包括：

100nM GR5-18；

100nM GR7-7；

1X反应缓冲液；

1X逆转录反应缓冲液；

0.1U/μL T4 Polynucleotide Kinase；

1X Buf.klenow；

0.75mM dNTPs；

100nM模板；

0.1U/μL Klenow Fragment(3'-5'exo^-)；

1X NEBuffer^TM2.1；

100nM Lba Cas12a；

100nM gRNA；

500nM报告分子；

分子级生物水；以及

不同浓度铅离子溶液；

将上述溶液涡旋混匀后置于PCR仪反应。