[发明专利]一种基于核酶-CRISPR的食品铅污染检测方法

说明书

本发明公开了一种基于核酶‑CRISPR的食品铅污染检测方法，利用核酶对铅离子的高度选择性及CRISPR相关蛋白Cas12a的反式切割活性的灵敏性对铅离子进行高灵敏定性、定量分析。通过报告分子的荧光强度变化指示铅离子的存在与否及浓度变化情况，将痕量铅离子浓度信号转化为荧光信号，提高检测灵敏度，降低实验检出限。同时避免了核酸扩增带来的假阳性问题。铅离子作为核酶酶链的辅酶，可以激活酶链的酶切活性并高效地切割底物链，缩短反应时间，为食品、环境中的痕量铅污染的快速检测提供了可能。本发明是不依赖于扩增的一管混反应，不仅灵敏，同时简化了实验操作。本发明对向导RNA(gRNA)的序列、预引物的长度、dsDNA靶标的长度及核酶臂长进行了优化，检出限为0.027nM。

技术领域

本发明涉及食品重金属污染检测领域，具体涉及一种基于核酶-CRISPR的食品铅污染检测方法。

背景技术

食品安全问题关乎公共卫生安全和人民生活质量。重金属污染问题是食品安全问题的重要诱因。铅离子由于其半衰期长、流动性强的特征，对人体健康有着潜在的长期威胁。研究表明，铅对人体中枢神经系统、血液循环系统有明显不良影响。饮食是人体摄入铅的主要途径，食品原料中的铅含量一般较低，通过生物链富集进入人体危害人体健康。因此通过检测食品原料中的痕量铅，可以更好地控制铅污染的食物链传播途径。功能核酸是在体外筛选的具有特异性识别功能的核酸序列，具有稳定性好、成本低等优势。其中核酶以其独特的催化活性和高度的特异性日益受到人们的广泛关注，铅离子核酶有DNAzyme 8-17及GR-5，研究表明GR-5对铅离子具有更好的选择性，因此本发明选择GR-5来产生预引物。

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)是原生细菌自带的免疫系统，包括Cas9、Cas12a、Cas13a、Cas14a等功能蛋白。Cas蛋白本身并不具有特异性切割作用，在向导RNA(gRNA)及靶标双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)的存在条件下，Cas蛋白-gRNA复合物对dsDNA或ssDNA的识别会激活Cas蛋白对靶标序列的切割活性，从而破坏外来入侵者的核酸序列，保护菌体安全。当gRNA存在时，gRNA与Cas12a蛋白形成复合物，此时Cas12a蛋白具有切割活性的结构域RuvC尚未打开，处于沉默状态。在gRNA的指引下，Cas12a蛋白复合物识别PAM序列，此时gRNA与靶标序列(target strand)相结合，靶标序列互补链(Non-target strand)被置换下来，形成R-loop构型，这种构型的形成会加速RuvC结构域的暴露，激活Cas蛋白的顺式切割活性(Cis-cleavage)及反式切割活性(Trans-cleavage)，值得注意的是，顺式切割完成以后，残留在Cas蛋白上的PAM末端仍能赋予Cas12蛋白反式切割活性，其对报告分子(Reporter)的非特异性切割在一定范围内将铅离子浓度信号转换为荧光信号。

CN201710560469.4公开了一种用于畜禽饮用水中铅离子检测的复合材料修饰电极，其包括石墨烯修饰玻碳电极和通过电化学沉积法原位负载在所述石墨烯修饰玻碳电极表面的纳米氧化钴修饰层。该发明将石墨烯玻碳电极作为碳材料负载基底，采用电化学沉积法将纳米氧化钴粒子原位负载在还原态石墨烯层上，利用二价钴离子与还原态石墨烯表面的含氧官能团发生键合作用，金属钴离子的纳米颗粒充当成核位点，该结构有利于阻碍纳米氧化钴团聚，从而提高了该复合材料修饰电极的导电性和灵敏度。但是该设计原理复杂，同时检出限较高，无法完成痕量铅离子的检测，因此无法从食物链初始端控制铅污染。

发明内容

鉴于上述不足，本发明的目的在于提供一种十分灵敏、高效的基于核酶-CRIPSR的铅离子检测方法。通过绘制标准曲线确定该方法的检出限、验证其在实际样品检测中可行性，从而得到一种方便快速、更为精准的检测铅离子方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种基于核酶-CRIPSR的食品铅污染检测方法，包括如下步骤：