[发明专利]一种中华鳖和中华草龟胚胎成纤维细胞永生化方法

说明书

本发明公开了一种中华鳖和中华草龟胚胎成纤维细胞永生化方法。将包含SV40大T抗原的重组慢病毒感染中华鳖或中华草龟的原代胚胎成纤维细胞后，用嘌呤霉素筛选获得中华鳖或中华草龟永生化胚胎成纤维细胞。本发明利用磷酸钙转染法制备包含SV40大T抗原的重组慢病毒，再用SV40慢病毒感染第3代原代胚胎成纤维细胞后用嘌呤霉素筛选永生化胚胎成纤维细胞，该方法经济简单而且费时较短。本发明成功的建立了中华鳖和中华草龟永生化胚胎成纤维细胞系。培养的ImPSEFs和ImMREFs均为贴壁生长，呈经典的细长纺锤形，能在30–34℃良好生长，最佳血清浓度为10％；可检测到成纤维细胞标记基因VIM和ACTA2的表达，以及SV40基因的表达；可用脂质体介导法进行细胞转染，转染率约为30％。

技术领域：

本发明属于生物领域，具体涉及一种中华鳖和中华草龟胚胎成纤维细胞永生化方法。

背景技术：

龟鳖类作为脊椎动物中极其特殊的一个分支，其生理结构、分子调控机制和进化机制具有重要的研究价值。龟壳是龟鳖类适应性进化的结构，有助于其在陆地、淡水和海洋生态系统中生存，龟壳又有软壳和硬壳之分。龟类的性别决定方式有遗传性别决定和环境性别决定多种性别决定方式并存。对这些独特的生物功能的调控机制和相关基因的研究，必然要到细胞中去寻找答案。然而目前关于龟鳖类细胞体外培养的研究只见原代细胞培养，如我们之前报道的红耳龟(Trachemys scripta elegans)原代胚胎成纤维细胞，西部锦龟(Chrysemyspicta bellii)、蛇鳄龟(Chelydra serpentina)、美国鳖(Apalone mutica)的原代肝脏和脾脏细胞，绿海龟(Chelonia mydas)心脏、肝脏等13种原代细胞，中华鳖(Pelodiscus sinensis)原代心脏细胞和肝脏细胞等，尚未见永生化细胞培养方法相关报道。近年来，为了提高作物产量，农业生产中使用了大量化学农药，残留农药通过地表径流和淋失进入水体和土壤，直接或间接对非靶标生物造成毒理危害。与此同时，随着工业、畜牧业和养殖业的快速发展，水体和土壤中出现了多种重金属残留，对生态环境造成了巨大的威胁。接触这些污染物会影响诸如蚯蚓、蜜蜂、龟类等动物的健康和存活率。建立龟鳖类永生细胞有助于揭示污染物对龟鳖类的毒性机制和毒理学作用，了解龟鳖类对外源性污染物的适应性、耐受性和解毒防御机制。

发明内容：

本发明提供一种中华鳖和中华草龟胚胎成纤维细胞永生化方法。

本发明的中华鳖和中华草龟胚胎成纤维细胞永生化方法，包括以下步骤：

将包含SV40大T抗原的重组慢病毒感染中华鳖或中华草龟的原代胚胎成纤维细胞后，用嘌呤霉素筛选获得中华鳖或中华草龟永生化胚胎成纤维细胞。

优选，所述的包含SV40大T抗原的重组慢病毒是将SV40大T抗原克隆进入慢病毒得到的。

优选，所述的原代胚胎成纤维细胞是第3代原代胚胎成纤维细胞。

优选，所述的用嘌呤霉素筛选是用2μg/mL嘌呤霉素筛选。

进一步优选，所述的用嘌呤霉素筛选是重组慢病毒感染中华鳖或中华草龟的原代胚胎成纤维细胞后加入含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基,对细胞进行筛选,获得中华鳖或中华草龟永生化胚胎成纤维细胞。