[发明专利]一种提高人表皮生长因子分泌生产效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高人表皮生长因子分泌生产效率的方法，将改造后的重组大肠杆菌于培养基中进行发酵；所述改造方法为采用以下任意一种或几种方式进行改造：A.弱化moaE基因、gshB基因、yceA基因、ychJ基因中的一个或几个基因的表达；B.强化bcsB基因、csgA基因、csgB基因、fimH基因中的一个或几个基因的表达。本发明所提供的方法提高了大肠杆菌分泌生产人表皮生长因子的能力，使得大肠杆菌在单批次游离发酵和固定化连续发酵中产人表皮生长因子的效率得到了1～2倍的提高，实现了人表皮生长因子的连续化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术和发酵工程领域，具体涉及到一种利用大肠杆菌提高人表皮生长因子分泌生产效率的方法。

背景技术

生物合成医药蛋白越来越受到人们的广泛关注，因为与化学合成相比，生物合成的安全性更高。大肠杆菌具有很多优势，如生长周期短、易于实现高密度培养、遗传背景明确以及外源基因转化速度快等，因此常用于表达重组蛋白。然而，实现重组蛋白的商业化生产仍然是一个挑战，最重要的问题之一是大肠杆菌分泌蛋白质的能力很差。在生产过程中包涵体的形成、蛋白降解、细胞代谢负担或表达蛋白的转运/运输系统效率低下等问题都会导致蛋白分泌效率低下。为了提高大肠杆菌的蛋白质分泌效率，人们尝试了很多方法，如选择高效的信号肽(如OmpA和PelB的信号序列)将蛋白质有引导至大肠杆菌蛋白分泌通路；对参与跨膜运输的关键转运蛋白或辅助蛋白进行修饰也被应用于提高蛋白质的分泌效率；此外，融合蛋白和分子伴侣的共表达也被证明可以增加蛋白质的表达和胞外分泌；其他改善蛋白质分泌的方法还包括优化发酵过程参数和培养基配方。

重组人表皮生长因子(rhEGF)是一种潜在的治疗性蛋白，被广泛用作各种慢性伤口的愈合剂，已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中使用PelB信号肽进行细胞外表达(中国专利号CN111471636A)。将hEGF分泌到培养基中大大简化了产品的回收，并减少了下游发酵过程中的分离成本。然而，hEGF的分泌效率不高且通常是以传统的游离发酵方式进行生产。在剪切力等压力条件下产人表皮生长因子细胞活力下降，不能连续化使用。目前已有一些提高人表皮生长因子蛋白分泌的研究，主要是通过优化密码子(中国专利号CN1360022A)、优化信号肽(中国专利号CN1854294A)、温度诱导(中国专利号CN102952817A)等方式实现产量提高。

为了提高hEGF蛋白分泌效率，本研究采取不同的思路以开发新的策略，如尝试从大肠杆菌生物被膜等生理过程相关的角度，考察了生物被膜形成相关基因或一些其他未知基因的表达对人表皮生长因子分泌效率的影响，并进一步创建基于生物被膜的连续发酵过程。大肠杆菌生物被膜由嵌入胞外聚合物(EPS)基质中的菌落组成，是一种复杂的细胞群落。包裹在生物膜中的细胞吸附在固体介质表面，能够通过吸收营养不断地进行自我更新并承受不利的条件。基于生物被膜的固定化连续发酵体系已应用于L-苏氨酸等小分子产品(中国专利号CN201910392765.7)的生产中，但是目前还没有应用于人表皮生产因子的报道，且大肠杆菌生物被膜相关基因(如bcsB、fimH、csgAB)以及其他一些生理基因(如moaE、gshB、yceA、ychJ)对hEGF分泌和生产的影响也未见报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌及其构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供一种提高人表皮生长因子分泌生产效率的方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种重组大肠杆菌，对大肠杆菌采用以下任意一种或几种方式进行改造；

A.弱化moaE基因、gshB基因、yceA基因、ychJ基因中的一个或几个基因的表达；

B.强化bcsB基因、csgA基因、csgB基因、fimH基因中的一个或几个基因的表达。