[发明专利]一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白的筛选方法与应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9(PCSK9)靶向结合蛋白的制备与应用。本发明通过噬菌体展示肽技术，筛选并制备一种与PCSK9靶向结合蛋白，本发明将为高胆固醇血症与动脉粥样硬化性心血管疾病的治疗与管理提供一种便捷、高效、稳定、低成本的选择。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9(PCSK9)靶向结合蛋白的制备及其在高胆固醇血症、动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)中的应用。

背景技术

高胆固醇血症是动脉粥样硬化性疾病的重要病理生理基础。降脂指南中推荐大剂量他汀类药物作为高危患者(如ASCVD)的血胆固醇管理办法，但存在治疗目标与不适反应之间的矛盾，包括：(一)指南要求ASCVD患者血清LDL-胆固醇1.8mmol/L，对于基线LDL-胆固醇水平较高且采用单药治疗的患者而言这一目标极其严格；(二)大剂量他汀类药物多有造成肝功能损害、横纹肌损害等不良反应的风险，部分患者难以耐受；(三)中等剂量他汀+胆固醇摄取抑制剂/胆酸促排剂效果有限。基于以上现实困难，针对新靶点的治疗方法日益得到重视。随着人们逐渐明确肝细胞合成分泌的PCSK9通过降解LDLR在高脂血症发挥作用，PCSK9单克隆抗体(mAb)治疗药物为高胆固醇血症甚至ASCVD的治疗与管理提供了新的重要途径。但mAb疗法存在一定的固有缺陷，包括：mAb含Fc段，无论是否人源化，都可能与免疫细胞产生交联交互，甚至有非目的性免疫反应发生的可能；mAb在体内有诱导抗药抗体(ADA)可能(依洛尤单抗、bococizumab均见报道)；且bococizumab的ADA因能与其他同类药物产生交叉抗药成为上市失败的重要原因之一；mAb制备依赖真核生物细胞，制备工艺复杂，费用昂贵，导致此类药物临床推广不足，使学界中出现了对mAb药效/支出比的质疑。因此，开发一种便捷、高效、稳定、低成本的PCSK9靶向结合蛋白有利于高胆固醇血症、ASCVD管理，势在必行。

发明内容

本发明的目的是通过噬菌体展示肽技术，筛选并制备一种PCSK9靶向结合蛋白，并对其进行功能验证。本发明将为高胆固醇血症与ASCVD的治疗与管理提供一种便捷、高效、稳定、低成本的选择。

本发明采用的技术方案：一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白的筛选方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌前蛋白酶9为PCSK9；所述的筛选方法为：通过噬菌体展示技术、基因测序、质粒稳转大规模表达技术，自噬菌体展示文库中筛选出一种与PCSK9靶向结合蛋白，所述的噬菌体展示肽筛选技术，将噬菌体展示文库在包被PCSK9蛋白的培养皿孵育，使用含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液冲洗，所述的含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液即为PBST；使用0.5％PBST将非结合性克隆洗脱，保留的结合性克隆经侵染大肠杆菌后以充分扩增、使用VCSM13辅助噬菌体营救发酵后沉淀以提取、聚乙二醇沉降后反复冲洗以纯化，获得筛选后收集的结合性噬菌体；所述的基因测序、质粒稳转表达技术为：将筛选后收集的结合性噬菌体行DNA测序，并将测序所得的核苷酸序列转换为蛋白氨基酸序列并比对，将合适序列制备为质粒，借助大肠杆菌体系表达合成；所述的PCSK9靶向结合蛋白，本蛋白是一种线性结构的蛋白质，由153个氨基酸残基组成，不含二硫键；可特异性的结合由细胞合成、分泌的PCSK9蛋白。所述的枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白其应用，其特征在于：所述的PCSK9靶向结合蛋白在治疗高胆固醇血症与动脉粥样硬化性心血管病中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本靶向结合蛋白通过原核细胞即可制备，与富含二硫键的mAb存在明显不同，克服了现有mAb制备方法中构建杂交瘤的复杂工艺、依赖真核生物细胞培养体系的昂贵费用、4℃及以上温度环境中易变性降解所致的储存困难；具有工艺简便、成本低廉、易于储存、避免反复冻融的特点。

本靶向结合蛋白不含mAb的Fc段，分子量远小于mAb，与免疫细胞产生交联交互、发生非目的性免疫反应、诱导ADA的可能性均低于mAb，避免了在临床研究中所报道的mAb类药物诱导非目的性免疫反应的固有难题。