[发明专利]HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用

权利要求书

1.HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型，其特征在于，以HepaRG细胞与HepG2细胞建立一个用于食品污染物肝毒性评测的体外肝毒性替代模型。

2.HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)细胞培养：将HepaRG细胞和HepG2细胞分别进行细胞培养；其中，HepaRG细胞培养选择William's E细胞培养基，其含有2-20％胎牛血清；HepG2细胞培养选择含4.5g/L葡萄糖的DMEM高糖细胞培养基，其含有2-20％胎牛血清；

2)细胞诱导：将HepaRG细胞接种于细胞培养皿内培养，将设定数量的HepaRG细胞以完全培养基贴壁生长3天后，更换为诱导培养基进行诱导培养，得到分化HepaRG细胞；

3)模型构建：将HepG2细胞与经诱导的HepaRG细胞分别接种于预定载体上培养，得到体外肝毒性替代模型。

3.如权利要求2所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，其特征在于，HepaRG细胞和HepG2细胞培养的培养基均含10％胎牛血清。

4.如权利要求2所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，其特征在于，建立的肝毒性评测模型对食品污染物进行评测，具体包括如下评测：

1)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种于96孔板内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，进行CCK8实验；

2)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种于24孔板内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯DCFH-DA对细胞进行染色，在荧光显微镜下进行细胞ROS的含量测定检；

3)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种6cm培养皿内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，使用四甲基罗丹明甲酯TMRM对细胞进行染色，在荧光显微镜下检测细胞的线粒体损伤；

4)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种10cm培养皿内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，收集细胞，超声破碎细胞，检测细胞氧化应激相关酶活力水平和肝功能酶活力水平；

5)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种6cm培养皿内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，收集细胞，通过LC-MS进行细胞广靶蛋白组学测定；

6)消化处理HepaRG和HepG2细胞，制成单细胞悬液，分别接种6孔板内；接种24h后，分别使用多种食品污染物进行染毒，收集细胞，根据组学结果，通过western blot对细胞筛选出的蛋白进行验证。

5.如权利要求4所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，其特征在于，食品污染物包括：真菌毒素、重金属、稀土元素。

6.如权利要求5所述的HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，其特征在于，肝毒性评测模型对食品污染物进行评测后，还包括通过动物实验进行体内验证，具体包括如下步骤：

1)将C57BL/6雄性小鼠分为对照组和多组不同剂量的化合物组，使用真菌毒素、重金属、稀土元素；分别经口染毒一个月；

2)每隔3日对小鼠进行称重，处死小鼠时记录小鼠的肝体比；

3)将染毒后小鼠的肝脏进行HE染色，检测小鼠的肝脏病理形态；

4)收集小鼠血清，进行肝功能酶活力水平的检测；匀浆小鼠肝脏组织进行氧化应激相关酶活力水平的检测；

5)选取重金属；染毒后的小鼠肝脏，通过LC-MS进行广靶蛋白组学测定。