[发明专利]HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法，本模型是以将两种人肝细胞在常规条件下培养、分化所得。经过分化后，HepaRG细胞对于化合物的代谢能力提高，敏感度增加。建立的模型可用于多种肝毒性化合物的检测，还可用于对已知肝毒性药物的毒性机制进行探索。经过体外验证后，显示本发明筛选出的肝毒性标志物适用食品污染物的肝毒性评测，其表达量可用于肝毒性等级划分。本发明HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型能在肝毒性药物的安全性评测中进行应用。本发明与传统肝功能指标相比测定结果更加稳定，并经过了动物实验的验证，弥补了以往对于食品污染物肝毒性体外研究的空白。

技术领域

本发明涉及替代毒理学技术领域。更具体地说，本发明涉及食品污染物肝毒性评测用细胞替代模型及其构建方法与其具体在真菌毒素、重金属、稀土元素评测中的应用。

背景技术

肝脏参与多种外来化合物的代谢和清除功能，是重要的代谢器官。外源性的食品污染物经过消化道吸收进入人体后，第一个重要的代谢器官便是肝脏。因此，肝脏是食品污染物毒性作用最重要的靶器官之一，对肝毒性的评价与检测至关重要。

长期以来，动物毒性试验是食品污染物肝毒性研究的主要方法。然而，传统的动物毒性试验要求大量的动物，且实验周期长、花费大，常被认为在伦理学和经济学方面不合理。同时，由于存在种属差异，动物研究结果外推到人的时候需要考虑污染物的代谢、靶标和病理生物学的不同，在预测人体毒性风险时会存在较大的不确定性。因此，近年来的研究将试验对象从动物转至细胞、体外三维培养的组织、离体组织等。体外肝细胞培养模型被认为是最主要和有效的替代体内模型评价肝毒性的方法。

由于具有天然完整的代谢酶家族以及转运蛋白，能够很好的预测人体内物质的代谢情况，并且方法相对快速方便，可信度高，人源性原代肝细胞培养模型(primaryhepatocytes, PHH)被认为是外源性物质代谢和细胞毒性研究的金标准。例如，欧洲替代方法验证中心 (ECVAM)的一项预验证实验显示，在3个独立的实验室的实验中，人源性原代肝细胞均对典型的细胞色素450酶系(CYP450)毒性诱导剂反应灵敏，结果重复性高，表明人源性肝细胞对于污染物的肝毒性是一种良好的评价模型。然而，由于人源性原代肝细胞来源极其有限，且生存周期较短，因此更适合短期的研究应用，不适合大规模的推广。相比较而言，人肝癌细胞系则拥有更长的生存期，细胞稳定性好，且拥有几乎和人源性原代肝细胞相同的代谢酶家族及转运蛋白，易获取也易大规模培养，更适合于大规模推广的体外肝毒性替代模型。

目前，国内外研究多利用人肝癌细胞系建立肝毒性体外替代模型，并研究各个指标作为检测终点时模型的诊断效能。其中，通过MTT、CCK-8法检测细胞活力，传统肝功能指标ALT、AST及氧化应激指标GSH、SOD、MDA等检测指标仍是体外肝毒性替代模型的经典指标。尽管上述生物标志物已应用于临床，然而国内外其他研究多只使用了传统肝功能指标ALT、AST及氧化应激指标GSH、SOD、MDA等指标的变化来说明肝毒性的强弱，但在多研究之间比较发现，不同毒性干预物和不同的毒理学方法检测较难检测到同样的指标变化，不能作为稳定的肝毒性标志物，因此有待进一步研究。

由此可知，目前缺乏适用于食品污染物的体外肝毒性测试模型，同时缺乏干预后能同时进行改变的标志物及其对靶标的动物实验验证。

发明内容

本发明的一个目的是提供HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型及其构建方法与应用，通过广靶蛋白组学，筛选出新的肝毒性标志物，与传统肝功能指标相比，测定结果更加稳定，并经过了动物实验的验证，弥补了以往对于食品污染物肝毒性体外研究的空白。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型，以HepaRG细胞与HepG2细胞建立一个用于食品污染物肝毒性评测的体外肝毒性替代模型。

本发明还提供了一种HepaRG和HepG2构建的体外肝毒性替代模型的构建方法，具体包括如下步骤：