[发明专利]一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌及其应用

权利要求书

1.一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建重组质粒pXY3-thl2-rRGS和pXY3-thl2-glyA；

步骤2，构建重组质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA

步骤3，将重组质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA甲基化修饰后转化至嗜甲基丁酸杆菌，即得重构嗜甲基丁酸杆菌BM/pXY3-rRGS-thl2-glyA。

2.根据权利要求1所述的一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，其特征在于，步骤1中重组质粒pXY3-thl2-rRGS构建方法为：选取引物，在实验室已有质粒pTrc99a-rGCS上复制来源于大肠杆菌的氨基甲基转移酶、甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸脱羧酶利用BamHI/Xba I酶切位点与载体pXY3连接。

3.根据权利要求1所述的一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，其特征在于，步骤1中重组质粒pXY3-thl2-glyA构建方法为：将来源于嗜甲基丁酸杆菌中的丝氨酸羟甲基转移酶利用BamHI/Xba I酶切位点与载体pXY3连接。

4.根据权利要求1所述的一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，其特征在于，步骤2中重组质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA构建方法为：选取引物，通过PCR以操纵子形式复制质粒pXY3-thl2-glyA中thl2启动子以及丝氨酸羟甲基转移酶，再利用XbaI /Xho I酶切位点与载体pXY3-thl2-rRGS连接。

5.根据权利要求1所述的一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，其特征在于，步骤3中pXY3-rRGS-thl2-glyA甲基化修饰并转化的方法为：将质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA转化至养含有pMCljs的大肠杆菌Top10中，培养并提取甲基化后的质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA，随后通过电转的方式转化至嗜甲基丁酸杆菌中，获得重构的嗜甲基丁酸杆菌BM/pXY3-rRGS-thl2-glyA。

6.基于权利要求1所述的重构嗜甲基丁酸杆菌在甲醇同化发酵生产丁酸上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在平板上挑取BM/pXY3-rRGS-thl2-glyA的单菌落，接种至含有红霉素的2ml YTF培养基中，培养12-16h后，将离心管中的菌液全部转接至安剖瓶中，生长至OD₆₀₀为1-1.2，将菌液倒入50ml离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清，用PB培养基重悬后以OD₆₀₀＝0 .1的接种量接种至50ml PB培养基中，再加入100mM-500mM甲醇、0-60mM碳酸氢钠 ,每隔一定时间，吸取2ml菌液，离心后将上清液转移至新的离心管保存，用于高效液相色谱检测甲醇、丁酸，用2ml超纯水重悬后检测其OD₆₀₀。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，添加100mM甲醇及20mM碳酸氢钠。