[发明专利]一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌及其应用

说明书

一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌及其应用。重构嗜甲基丁酸杆菌中包括天然WLP途径同化甲醇；所述重构嗜甲基丁酸杆菌中导入的基因包括来源于大肠杆菌的甘氨酸裂解系统氨基甲基转移酶（GcvT）、甘氨酸裂解系统H蛋白（GcvH）、甘氨酸脱羧酶（GcvP），过表达内源的丝氨酸羟甲基转移酶（glyA）。重构的嗜甲基丁酸杆菌在以甲醇为唯一碳源中发酵验证发现较原始菌株的最大生物量提高了55.26%，甲醇同化量提高了34.47%，同时将重构菌株发酵生产合成丁酸的发酵条件进行优化，其最终最大生物量提高了55.26%，甲醇同化量提高了57.14%，丁酸合成量提高了77.78%。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌及其应用。

背景技术

甲醇（Methanol，CH₃OH）为结构最简单的饱和一元醇，是重要的碳一化合物平台之一。随着人类对化石燃料勘探、挖掘技术不断提高，自20世纪50年代以来生产甲醇的方法逐渐由干馏法发展为化学合成法，包括加压催化从化石燃料而来的合成气、直接氧化甲烷、还原大气中二氧化碳和氢气。丰富的原料和生产项目大量涌现，使得甲醇产能持续快速增长，2018年全球生产甲醇总量可达1.1亿吨，而当年甲醇需求量为8-9千万吨。甲醇还原力较高，其每个碳还原度比葡萄糖每个碳还原度高2，可用于增强某些还原性产物的生产，如羧酸、醇和脂肪酸。利用来源丰富、产能过剩的甲醇进行微生物法生产化学品，较传统发酵工艺有着更为经济且可持续发展优势，作为非粮食原料甲醇可提供较高还原力，对减轻生物制造业对粮食生物质的依赖具有重要意义。

嗜甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum，BM），细菌学分类为梭菌属，是一种专性厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌。嗜甲基丁酸杆菌可同时利用多种碳一原料进行发酵，包括甲醇、CO₂和CO等。作为天然利用甲醇菌株，嗜甲基丁酸杆菌与好氧甲基营养菌有所不同，甲醇代谢途径还原力消耗较少，主要用于代谢产物的积累，同时菌株具有对甲醇的耐受性高，代谢甲醇速率较快等优势，其发酵主要产物是羧酸、丁酸和相应的醇类等，在生物制造业上有一定研究价值。

目前的研究主要集中在嗜甲基丁酸杆菌的发酵条件和培养基筛选等方面，并未涉及到相关基因工程改造等，限制菌株发展和应用。在嗜甲基丁酸杆菌中存在一条能够天然同化甲醇的代谢途径：WLP途径，但是其甲醇消耗速率以及丁酸合成效率仍然有进一步提高的空间，通过人工构建一条甲醇同化途径，还原性甘氨酸途径能够与WLP协同作用，进一步提高甲醇同化及丁酸合成效率，同时还原性甘氨酸途径还能固定CO₂，符合绿色可持续发展理念。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌及其应用，该构建首次提出了在嗜甲基丁酸杆菌中利用人工构建的甲醇同化途径还原性甘氨酸途径与天然甲醇同化途径WLP途径系统利用，提高了甲醇同化及产物丁酸合成效率，为未来嗜甲基丁酸杆菌生产化合物奠定了基础，具有深远意义。

一种利用WLP途径和还原性甘氨酸途径协同同化甲醇的重构嗜甲基丁酸杆菌，包括以下步骤：

步骤1，构建重组质粒：pXY3-thl2-rRGS和pXY3-thl2-glyA；

步骤2，构建重组质粒：pXY3-rRGS-thl2-glyA

步骤3，将重组质粒pXY3-rRGS-thl2-glyA甲基化修饰后转化至嗜甲基丁酸杆菌，即得重构嗜甲基丁酸杆菌BM/pXY3-rRGS-thl2-glyA。

作为改进的是，步骤1中重组质粒pXY3-thl2-rRGS构建方法为：选取引物，在实验室已有质粒： pTrc99a-rGCS上复制来源于大肠杆菌的氨基甲基转移酶、甘氨酸裂解系统H蛋白、甘氨酸脱羧酶利用BamHI/Xba I酶切位点与载体pXY3连接。