[发明专利]一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法

权利要求书

1.一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，包括以下步骤：

S1：建立二维PCR的探针及标签库；

S2：设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化；

S3：二维PCR技术应用及性能评估。

2.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，所述步骤S1包括：

S11：针对常用的FAM、VIC、Cy5三个荧光检测通道，设计三个探针序列，并在5'端添加相应的荧光基团，3'端由磷酸基团封闭，如表1所示：

表1

S12：针对标签的反向互补序列即前标签设计多组与前标签同源的序列，以FAM荧光通道为例，前标签如表2所示：

表2

S13：将每组前标签序列与其对应的碱基猝灭探针进行熔解温度的探索，以FAM荧光通道为例，猝灭探针基团序列如表3所示；每管25μL PCR反应体系组成如下：2.5μL的10x无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子溶液，0.5μL的4×10mM dNTPs，0.25μL的5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1μL 10μM的前标签，0.1μL的10μM的探针，加入去离子水补足反应体系至25μL；PCR反应程序如下：95℃10秒，30℃4分钟，而后荧光信号收集时温度持续上升至80℃；并依据获得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前标签序列进行筛选,建立合适的探针及标签库。

表3

3.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，所述步骤S2包括：

S21：选择16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的共计13种高危型HPV基因亚型；人血红蛋白β亚基和血红蛋白δ亚基基因作为内参基因，用同一对引物扩增这两个基因，以下称HBBHBD基因，并视为一个待检基因；

S22：设计三荧光通道检测模式：FAM荧光检测通道检测HPV16、18、31、33、58型及HBBHBD基因；VIC荧光检测通道检测HPV35、39、45、51、52型；Cy5荧光检测通道中检测HPV56、59、68型；

S23：制备FAM荧光检测通道、VIC荧光检测通道及Cy5荧光检测通道的引物及探针，以FAM荧光检测通道为例，如表4所示；引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10μM；

表4

S24：制备包含不同HPV扩增子的质粒样本，质粒样本原液进行稀释，稀释完成后，每个HPV亚型质粒样本选用七个稀释的样本，浓度在10^1拷贝/μL到10^7拷贝/μL进行后续实验，余质粒样本予以冻存；

S25：进行单对引物单基因检测实验，以保证引物能成功扩增靶基因，探针能成功检测出待检靶基因；

S26：运用热启动Taq酶体系设计二维PCR反应体系；

设计每管25μL二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×Immobuffer缓冲液，0.5μL50mM镁离子熔液，0.7μL的4×2.5mM dNTPs，0.5μL的5U/μL IMMOLASE DNA聚合酶，0.4μL的浓度为10μM探针，0.1μL浓度为10μM的每个带标签靶基因特异性引物，0.1μL浓度为10μM的每个靶基因不带标签引物，而后加入去离子水使得PCR反应体系达到23μL，最后加入2μL样本；

S27：带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验；

将带标签引物固定在每25μL反应体系0.1μL，而后调整不带标签引物的量从高到低为0.2μL，0.3μL，0.6μL和0.8μL，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找带标签引物与不带标签引物用量最优比例；

S28：探针浓度优化实验；

在带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验结果基础上设计探针的用量由低到高分别为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL以及0.5μL共5个反应体系，除了探针的用量和相应的去离子水的用量不同外，其余反应体系的组成成分相同；进行二维PCR反应寻找最优探针浓度；

S29：镁离子浓度优化实验；

设计镁离子量由低到高分别为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL共5个反应体系，其余反应体系与引物和探针优化后的相同；进行二维PCR反应寻找最佳镁离子浓度。