[发明专利]一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法

说明书

本发明公开了一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，主要包括建立二维PCR的探针及标签库、设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化和二维PCR技术应用及性能评估三大步骤。本发明建立了高通量二维PCR单管闭管检测13种高危型HPV的检测方法，通过对方法的灵敏度、特异性等一系列指标分析评估应用于临床筛查的潜力，为临床的快速筛查诊治提供依据。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法。

背景技术

宫颈癌位居女性恶性肿瘤发病率第二位，占全世界因癌症死亡的女性的7％以上。宫颈癌前病变又称为宫颈上皮内瘤变(CINs)，和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关。目前，全球HPV的感染率持续上升，数据统计，每年约有50万患者被诊断为宫颈癌，在全球范围内造成超过25万患者死亡；在中国宫颈癌发病率同样呈现上升趋势，并趋于向年轻化。85％宫颈癌发生在筛查计划无效的发展中国家，近一半的宫颈癌患者在诊断前没有进行筛查，另外10％的患者在过去五年内没有进行筛查。早期筛查与干预是降低宫颈癌发病率与死亡率的有效手段。HPV检测联合细胞学检查作为早期筛查手段可以发现癌前病变及早期宫颈癌，给临床诊断提供依据。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型环状双链DNA病毒，其基因组分为3个区域，包括早期转录区(E区，包含基因E1－E7)、晚期转录区(L区，包含基因L1和L2)和非编码区(也称长控制区，位于L1和E6开放阅读框架之间)。根据编码衣壳蛋白L1区基因序列差异，可将HPV分为不同亚型。HPV的类型分为低风险(引起疣)和高风险(致癌)。高危型HPV有HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68，共13种；低危型HPV有HPV-6、-11、-42、-43、-44，共5种。宫颈癌前病变又称为宫颈上皮内瘤变(CINs)，和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关，持续的高危型HPV感染导致99％以上的宫颈癌。其中HPV16型和18型是导致70％宫颈癌的高危亚型。持续的低风险基因型HPV-6和HPV-11可致大多数的生殖器疣和呼吸道乳头状瘤病，但很少与癌症相关。高风险HPV基因型还可导致肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌和口咽癌。因此HPV检测有利于生殖器疣、呼吸道乳头状瘤病以及包括宫颈癌在内的多种肿瘤的早期筛查和预防。

目前HPV的检测主要是基于DNA水平的分子生物学方法。对于主要有第二代杂交捕获技术(HC2)、PCR、基因芯片等。HC2是第一个通过美国FDA批准的HPV临床诊断方法，其优势是操作方便，适于大范围人群筛查，结果客观、稳定、重复性好，但它只能区分高危型和低危型，而不能进行HPV个体基因分型；基因芯片技术是一种依赖于固相载体的技术，有众多的优点，但它主要运用于研究宫颈疾病和HPV各亚型的关系中，临床检测中大规模运用与推广尚有难度；PCR技术检测靶基因便捷快速、不需要昂贵的仪器和试剂、操作简单，非常适用于临床标本的大规模筛检。HPV的DNA的检测，有特异引物和通用引物两种方法。但传统PCR的单管单基因检测逐渐显露出通量过小、大批量多基因检测耗时长的弊端。而基于多重PCR的高通量基因检测技术根据产物鉴定方法的不同，主要分为开管检测和闭管检测两大类。开管检测取出PCR产物借助电泳、质谱、液相芯片和测序等技术鉴别产物。需要额外设备，步骤繁琐，检测时间较长，且开盖容易造成实验室污染，从而导致假阳性结果。闭管检测无需开盖操作，通过分析荧光进行产物鉴别，主要分为高分辨熔解曲线法、荧光熔解曲线分析法和基于多色荧光通道的TaqMan探针技术等。这些方法虽然检测时间短，污染风险小，但仍然存在单管反应检测通量不足的问题。

因此，如果在闭管条件下，单管PCR反应就能实现批量基因的筛查或分型，将会大大提升临床疾病的诊治速度。

前面的叙述在于提供一般的背景信息，并不一定构成现有技术。

发明内容