[发明专利]一种嵌合体抗原和抗金环蛇蛇毒制剂的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种嵌合体抗原为马IgG的Fc和4个金环蛇蛇毒磷酸二酯酶的嵌合体蛋白；马IgG选自马IgG4、IgG1‑3或IgG5‑7；4个金环蛇蛇毒磷酸二酯酶为PA2B1突变截短体、PA2B2突变截短体、PA2B6突变截短体和PA2A截短体。本发明还公开了马抗金环蛇蛇毒制剂包含马抗金环蛇蛇毒F(ab’)₂；马抗金环蛇蛇毒F(ab’)₂通过以灭活金环蛇蛇毒和如上的嵌合体抗原混合物作为抗原，辅以佐剂，免疫马匹来制备获得；佐剂包括SEB+IL‑4+IL‑6。本发明所产生的抗金环蛇蛇毒的抗血清其效价增高了3倍以上；可高表达、高纯度(达到90％以上)地获得具有生物学活性的马抗金环蛇蛇毒的F(ab’)₂。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域和动物免疫领域，尤其涉及一种嵌合体抗原和抗金环蛇蛇毒制剂的制备方法及其应用。

背景技术

蛇是爬行纲有鳞目蛇亚目动物，按现行分类系统，共分为三亚目、十一科。包括盲蛇亚目：盲蛇科、异鳞蛇科和细盲蛇科；原蛇亚目：蟒科、筒蛇科、针尾蛇科、内鳞蛇科和瘰鳞蛇科；新蛇亚目：游蛇科(细分多个亚科)、眼镜蛇科(眼镜蛇亚科、扁尾蛇亚科、海蛇亚科)和蝰科(白头蝰亚科、蝰亚科、蝮亚科)，除游蛇科大部分外，此亚目都是毒蛇。全世界共有蛇类3340多种，毒蛇超过660种，致命性毒蛇近200种；游蛇1700种以上，其中100余种含少量毒素或低毒类蛇，极少数可能致命。我国有210多种，隶9科66属，其中毒蛇60余种，剧毒类10余种。我国常见毒蛇,根据蛇毒对机体的效应分为神经毒类、血液毒类、细胞毒类和混合毒类蛇。①神经毒类：金环蛇、银环蛇、海蛇等。②血液毒类：竹叶青、烙铁头、蝰蛇等。③细胞毒类：眼镜蛇等。④混合毒类：眼镜王蛇、蝮蛇、尖吻蝮(五步蛇)等(2018年中国蛇伤救治专家共识，中国蛇伤救治专家共识专家组)。

抗蛇毒免疫球蛋白被公认为是目前治疗毒蛇咬伤最有效的药物。目前，全世界绝大多数抗蛇毒免疫球蛋白来源的主要途径仍然是高免马匹血浆中多克隆抗体的分离。在抗蛇毒生产过程中，免疫程序的合理选择是十分重要的。低剂量、低体积和多位点免疫的免疫方法可以有助于免疫应答细胞与抗原良好接触，取得好的免疫效果。从100多年前开始，生产工艺由粗制到精制，经历了3次主要的技术改进：由针对毒液的粗制抗血清(antiserum)产品(即第一代抗毒素)发展到纯度较高的免疫球蛋白(即第二代抗毒素)，再到用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化、盐析或亲和色谱纯化去除免疫球蛋白lgG的Fc端后得到的单价Fab或双价F(ab’)₂片段(即第三代抗毒素)。我国于20世纪50年代开始由上海生物制品研究所开始研制抗蛇毒血清，相继研制出抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清、抗蝰蛇毒血清、抗金环蛇蛇毒血清和抗银环蛇毒血清(抗蛇毒免疫球蛋白药物研发的现状和策略，田靖2015)。到目前为止，我国生产蛇毒抗毒素的企业仅有上海赛伦生物技术股份有限公司(简称赛伦生物)一家，上市销售4种蛇毒抗毒素单价液体制剂，即抗蝮蛇毒、抗五步蛇毒、抗眼镜蛇毒和抗银环蛇蛇毒的单价免疫球蛋白F(ab’)₂分子。赛伦生物采用弗氏不完全佐剂(FIA)加小剂量减毒蛇毒基础免疫马，休息两个月后正式免疫，剂量逐渐加大，直至免疫成功。

金环蛇(Bungarus如sciatus)属眼镜蛇科环蛇属，是以神经毒为主的剧毒蛇类。常于清晨或午夜出没在丘陵、山溪、小沟或田边草丛中，人们从事生产劳动或野外作业、夜间行路碰(踩)到蛇体时被咬伤而中毒，甚至呼吸衰竭而死亡。金环蛇咬伤发病事低，占毒蛇咬伤的2.3％，病死率为2.15％。金环蛇咬伤中毒死亡的主要原因为神经毒紊和心脏毒素相互作用所致。国内也有人在实验室层次上对抗金环蛇蛇毒血清研制，如郑颖等以金环蛇蛇毒为免疫原免疫马获得免疫血浆。经盐析制备IgG，IgG再经酵解、疏水柱纯化后得到F(ab’)₂活性片段，并以免疫扩散、酶联免疫吸附法(ELISA)测定其抗体特异性和小鼠试验法测定其中和金环蛇蛇毒能力，得到了高纯度的抗金环蛇蛇毒血清(抗金环蛇蛇毒血清生产工艺的研究，2007)。但是，在我国还没有抗金环蛇蛇毒血清的生产。临床一般会采用抗银环蛇毒血清来治疗金环蛇咬伤，但抗银环蛇毒血清对金环蛇蛇毒的中和效价较低且血清使用量大。