[发明专利]基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子

权利要求书

1.基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，以小檗碱作为荧光探针，利用小檗碱和汞离子的嵌合适配体，通过核酸外切酶Ⅰ降低荧光信号背景，其步骤如下：

步骤一、将2μM嵌合适配体序列aacataaatattaaattatgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattctttcttctttc与1.5μM互补序列gtttgttgtttgtt分别在95℃加热5min，然后快速冷却至0℃，在15℃放置20min，备用；

步骤二、将10μL 2μM嵌合适配体，10μL 1.5μM互补序列，30μL不同浓度的Hg²⁺，100μL20mM Tris-HCl缓冲液60μM MgCl₂，75mM NaCl，pH 7.5混匀，在25℃金属浴中反应25min，形成t-Hg²⁺-t的错配结构；

步骤三、在步骤二的反应液中加入30μL 1mM小檗碱溶液，在25℃金属浴中反应25min，使小檗碱与其适配体序列结合；

步骤四、在步骤三的反应液中加入20μL核酸外切酶Ⅰ的缓冲液和0.4μL 10U/μL核酸外切酶Ⅰ，在37℃反应20min后，于80℃灭酶15min；

步骤五、在步骤四的反应液中加入100μL Tris-HCl缓冲液60μM MgCl₂，75mM NaCl，pH7.5，将反应体系定容至300μL；在室温下使用荧光分光光度计测定溶液的荧光发射光谱。

2.如权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，步骤一所述的嵌合适配体序列为aacataaatattaaattatgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattctttcttctttc，互补序列为gtttgttgtttgtt。

3.如权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，步骤二所述的10μL 2μM嵌合适配体，10μL 1.5μM互补序列。

4.如权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，步骤四所述的0.4μL 10U/μL核酸外切酶Ⅰ。

5.如权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，步骤五所述的测定荧光发射光谱时，参数设置为激发波长为436nm，扫描范围为465-650nm，激发狭缝为5nm、发射狭缝为10nm，设置响应时间为0.1s。

6.如权利要求1所述的基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其特征在于，步骤五所述的该荧光法最佳发射波长为530nm。