[发明专利]基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子

说明书

本发明公开了一种基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子。以小檗碱为荧光探针，利用核酸外切酶I降低背景信号，当有Hg²⁺时，嵌合适配体与互补序列形成t‑Hg²⁺‑t构型，可有效抵抗ExoⅠ的水解作用，小檗碱呈现强的荧光。相反，在没有Hg²⁺的情况下，嵌合适配体与互补序列被ExoⅠ水解，小檗碱呈现低的荧光背景。所构建的免标记嵌合适配体荧光传感体系用于汞离子的分析(线性范围0.01‑1.0μM,检出限2nM)，为汞离子提供了一种简单快速，经济灵敏的新检测方法，该方法成功用于实际自来水样品的中Hg²⁺检测，加标回收率为94.66‑106.63％，具有良好的实用性。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，以小檗碱作为荧光探针，利用小檗碱和汞离子的嵌合适配体，通过核酸外切酶Ⅰ降低荧光信号背景，建立了无标记荧光适配体检测汞离子的生物传感方法，具有良好的特异性和灵敏度，并应用于自来水中汞离子的检测，为无标记检测汞离子提供了一种、快速、简单和低成本的新方法。

背景技术

汞是重金属污染物中的一种，广泛存在于空气、水和土壤中。汞在自然界中存在形式多样，包括金属汞，有机汞和无机汞。无机汞中的水溶性汞离子会通过食物链富集，进入人体后，水溶性汞离子会发生甲基化作用形成甲基汞，即使很少的浓度也会对人体造成不可逆的伤害。传统汞含量检测的方法包括原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法，原子荧光光谱法，酶联免疫吸附法和高效液相色谱法等。这些方法的检出限很低，但是需要大型仪器和专业人员进行操作，检测成本较高。因此，需要开发简单、灵敏、经济的方法检测汞含量。

核酸适配体是通过配体富集系统进化(SELEX)技术在体外筛选出的寡核苷酸，与靶标物质具有高特异性与亲和性。到目前为止，已经筛选出Pb²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Ag⁺和As³⁺等常见重金属离子的DNA适配体。据报道，Hg²⁺可以同富含胸腺嘧啶(t)的ssDNA形成t-Hg²⁺-t碱基错配复合物，ssDNA形成双螺旋结构。此特性为本方法采用核酸适配体作为识别探针特异性识别Hg²⁺提供了基础与思路。

小檗碱是一种安全，无毒，低廉的生物碱，从植物中提取获得。小檗碱在水溶液中荧光发射较弱，但小檗碱与核酸适配体具有结合亲和性，其与双链DNA结合之后荧光信号增强。除此之外，有报道称，小檗碱与其特异性适配体结合，使小檗碱本体的荧光增强。因此，我们设计了嵌合适配体，同时捕获识别小檗碱与Hg²⁺。核酸外切酶I(ExoⅠ)是一类蛋白酶，对单链DNA具有特异性，从3’端到5’端剪切单链DNA。利用核酸外切酶Ⅰ的特性，可以有效提高检测灵敏度。

本研究利用小檗碱与其特异性适配体结合之后荧光增强的特性，结合小檗碱和汞离子的嵌合适配体，再利用ExoⅠ辅助信号放大，构建免标记的嵌合型核酸适配体荧光传感体系并用于汞离子的灵敏检测。

发明内容

本发明针对目前汞离子检测所存在的检测仪器操作复杂，检测成本高，实际样品前处理繁琐等问题，利用小檗碱为荧光探针构建核酸外切酶Ⅰ辅助的免标记核酸适配体荧光传感体系用于汞离子的检测，为检测汞离子提供了一种快速，经济，灵敏的新检测方法，促进这种检测方法的实用化。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

基于核酸外切酶Ⅰ和嵌合适配体无标记荧光检测汞离子，其步骤如下：

步骤一、将2μM嵌合适配体序列(aacataaatattaaattatgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattctttcttctttc)与1.5μM互补序列(gtttgttgtttgtt)分别在95℃加热5min，然后快速冷却至0℃，在15℃放置20min，备用。