[发明专利]一种用于直接PCR扩增的试剂及检测试剂盒和应用

说明书

本发明公开了一种用于直接PCR扩增的试剂及核酸检测试剂盒和应用。所述试剂包括NP40和十二烷基肌氨酸钠，所述NP40在PCR反应体系中的体积百分比为0.1%~2%，十二烷基肌氨酸钠在PCR反应体系中的体积百分比为0.1%~2%。本发明对比了不同的表面活性剂，发现十二烷基肌氨酸钠和NP40的组合使用不仅具有核酸释放的功能，同时也不会对PCR反应有抑制，可以更好的实现咽拭子样本的直接PCR扩增。本发明提供的直接PCR扩增试剂，可以实现半小时从样本到结果的新冠核酸检测；大大缩短了目前新冠病毒的检测时间同时简化操作流程。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种用于直接PCR扩增的试剂及检测试剂盒和应用。

背景技术

目前市面上有基于等温扩增技术实现快速检测的核酸检测试剂盒，但是整体的灵敏度偏低，而常规的荧光定量PCR检测技术虽然具有较高的检测灵敏度和特异性，但是几乎都需要扩增前的核酸纯化提取步骤或者核酸释放步骤，操作繁琐。

直接PCR（Direct PCR）是一种不经核酸提取而直接对生物样本进行扩增的反应，是目前分子诊断领域的热门技术之一。与常规PCR的主要区别在于，样本可不经过核酸抽提，直接进行PCR反应，因此对于参与直接PCR反应的酶的耐受性和缓冲液的兼容性有较高的要求。

现有技术中的核酸免提取技术，例如专利200910309980.2，202010072514.3等虽然公布了一种具有核酸释放功能的试剂，但有一个共性是均使用了SDS这种表面活性剂，然而SDS试剂对PCR扩增有严重的抑制作用，会导致PCR的扩增效率降低。

发明内容

本发明的目的是，提供一种用于直接PCR扩增的试剂及检测试剂盒和应用。旨在提高核酸免提取技术中直接PCR扩增的反应效率。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种用于直接PCR扩增的试剂，所述试剂各组分在PCR反应体系中的浓度为：NP40体积百分比为0.1%~2%，十二烷基肌氨酸钠 体积百分比为0.1%~2%，Tris-HCl 30~50mM，麦芽糖 5wt%~10wt%，半乳糖醇 4wt%~6wt%，Taq酶 1-3U，反转录酶 5-20U，RNA酶抑制剂 5-20U。

作为优选实施方案，所述十二烷基肌氨酸钠在PCR反应体系中的体积百分比为0.3%~2%。

作为优选实施方案，所述NP40在PCR反应体系中的体积百分比为0.8%~1.2%，十二烷基肌氨酸钠在PCR反应体系中的体积百分比为0.4%~1%。

作为优选实施方案，所述试剂还包括dNTP 0.4~0.5mM、Mg²⁺ 2~5mM、KCl 30-50mM、硫酸铵 5~20mM、BSA 0.1wt%~1wt%。

所述dNTP包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，此处的0.4~0.5mM dNTP是指dATP、dGTP、dCTP、dTTP各自均为0.4~0.5mM

本发明还提供所述的试剂在制备检测新冠病毒试剂盒中的应用。

作为优选实施方案，所述试剂盒对新冠病毒的ORF1ab基因和/或N基因进行检测，检测ORF1ab基因的引物如SEQ ID NO.1~2所示、探针如SEQ ID NO.3所示；检测N基因的引物如SEQ ID NO.12~13所示、探针如SEQ ID NO.14所示。

作为优选实施方案，所述引物在PCR反应体系中的浓度为240~400nM，所述探针在PCR反应体系中的浓度为120~200nM。

作为优选实施方案，采用人源靶标RNase P作为内标，内标引物如SEQ ID NO.17~18所示、探针如SEQ ID NO.19所示。

本发明涉及的英文缩写注释如下：