[发明专利]一种复发肺癌穿刺样本类器官培养基及其应用

权利要求书

1.一种复发肺癌细胞类器官培养基，其特征在于，所述培养基包含如下组分：DMEM/F12K/1640培养基1:1:1-2，抗坏血酸1-100mg/L，L-谷氨酸1-100mg/L，亚硒酸钠0.002-0.5mg/L，乙醇胺盐酸盐2-200mg/L，偏钒酸铵1×10^-4-20×10^-4mg/L，四水合氯化锰5×10^-5-50×10^-5mg/L，R-spondin1 50-1000ng/ml，Noggin10-200ng/ml，N2:B27(0.1×-2×)，谷氨酰胺补剂(1×)，HEPES(1×)，烟酰胺1-100mM，Normocin^TM(1×)，N-乙酰半胱氨酸0.1-10mM，Wnt3a10-500ng/ml。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括以下物质的一种或多种：A83-01、EGF，Gastrin I。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述A83-01浓度为0.1-50μM；所述EGF浓度为10-200ng/ml；所述Gastrin I浓度为5-25nM。

4.根据前述任一权利要求所述的培养基，其特征在于所述培养基中还包括下述物质的一种或多种的组合：肝素，FGF2，HGF，优选的，所述肝素的浓度为1-200IU/ml，所述FGF2浓度为1-100ng/ml；所述HGF浓度为5-500ng/ml。

5.根据前述任一权利要求所述的培养基，其特征在于所述培养基中还包括CHIR99021，优选的，所述CHIR99021浓度为1-20μM，和/或，所述培养基中还包括DMSO，优选的，所述二甲亚砜浓度为培养基体积比的0.01-2％。

6.一种利用上述任一权利要求所述培养基培养复发肺癌细胞类器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1).取复发肺癌穿刺样本，4℃保存于专用保存液中，24小时内低温转移至操作室；

2).样本低温破碎，酶解消化；

3).低温离心去除上清，冰PBS重悬，此过程重复3-5次；

4).低温离心去除上清，依据获得细胞情况，1-5ml冰PBS重悬后显微镜下计数细胞；

5).低温离心去除上清，依据细胞计数加入适量冰Matrigel重悬接种于24孔板，加入肺癌培养液，每3天更换一次相应培养液；

6).肿瘤类器官培养6-12天后，每孔添加1ml冰PBS，反复吹打，移入15ml离心管；

7).低温离心去除上清，冰PBS重悬，此步骤重复3-5次，直至Matrigel全部清除；

8).离心结束后，冰Matrigel重悬，1:3接种扩增；

9).待肿瘤类器官稳定传代后，重复步骤8，一半类器官做药物敏感性实验，一半类器官用细胞冻存液冻存。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)消化使用的是胶原蛋白酶。

8.根据权利要求6-7任一项所述的方法，低温离心去除上清的操作中，温度为4℃，离心转速为70-300g。

9.权利要求1-5任一所述培养基或权利要求6-8任一项所述的方法在制备复发性肺癌类器官模型中的应用。

10.由前述任一权利要求获得的类器官模型在筛选靶向复发性肺癌药物中的应用。