[发明专利]一株野生型屎肠球菌ZK03及其电击转化方法和应用

说明书

一株野生型屎肠球菌ZK03及其电击转化方法和应用，属于微生物领域。该菌株已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCCNo:62192。该菌株不含肠球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。该菌株具有良好的耐酸、耐猪胆盐、耐高温和耐生理盐水特性，且在室温生理盐水中可长期存活；该菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌具有一定抑制作用，可用于制备抑菌剂，同时还可作为饲料添加剂发酵生产饲料。本发明的一株野生型屎肠球菌ZK03的电击转化方法，操作简单，转化效率高，重复性强。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株野生型屎肠球菌(Enterococcusfaecium)ZK03及其电击转化方法和应用。

背景技术

屎肠球菌(Enterococcus Faecium，E.faecium)是人和动物肠道正常菌群之一，属于革兰氏阳性球菌，无荚膜和鞭毛，具有良好的耐酸、耐高温和耐胆盐的性质。根据大量文献报道，屎肠球菌能够产生乳酸、细菌素、过氧化氢等物质，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌等有一定的抑制作用。在食品中，屎肠球菌发酵有助于产生香气和风味，延长货架期，改善微生物环境。在畜牧养殖中，屎肠球菌常被用来作为替康产品之一，具有良好的应用前景。由于屎肠球菌具有较厚的细胞壁结构以及毒力基因的存在，限制了其发展和应用。

电转化法是革兰氏阳性细菌最常用的引入外源DNA分子的方法之一。但是目前关于专门适用于屎肠球菌电转化的方法不是很多，因此，通常参考乳酸乳球菌电转化的方法进行屎肠球菌的电转化，由于屎肠球菌的异质性比较大，电转化条件不均一，因此乳酸乳球菌电转化方法应用在屎肠球菌上时存在转化效率较低的问题，提高了转化难度，且现有电转化方法操作繁琐，甚至难以获得阳性转化子。

发明内容

本发明的目的是提供一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03及其电击转化方法和应用。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03，该菌株已于2022年1月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:62192。

作为优选的实施方式，该菌株不含有肠球菌毒力因子Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl。

本发明的一株野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03的电击转化方法，包括以下步骤：

步骤一、野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞的制备将活化的野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03接种于含1～3％(M/V)甘氨酸的改良培养基中，培养至平台期或平台后期，收集菌液，冰浴、离心收集菌体，用含30％(M/V)PEG1000的电击缓冲液进行洗涤、重悬，置于-80℃保存；

步骤二、电击转化

按体积比为3:1的比例取野生型屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZK03感受态细胞和穿梭质粒PAMB401，冰浴后混匀，加入预冷的电转杯中静置后，电击1次，电压为1400～2450V，电击时间为4～5ms；加入复苏培养基，取培养物涂布于筛选培养基中，完成电击转化过程。

作为优选的实施方式，步骤一中，所述改良培养基为含有171.15g/L蔗糖和2％(M/V)甘氨酸的BHI液体培养基。

作为优选的实施方式，步骤一中，所述电击缓冲液的配制方法为：取100ml超纯水经高压湿热灭菌处理后冷却至50～60℃，加入30g PEG1000，0.45μm滤膜过滤除菌即得。