[发明专利]用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包

说明书

本发明公开了用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。通过更换起始密码子降低了TPR1的表达强度，获得了可用于酿酒酵母基因组高拷贝整合的重组质粒。更换TRP1的启动子为AAG或者GUG后的TRR1_AAGdeg和TRR1_GUGdeg具有良好的高拷贝整合能力，使转化后的菌株的荧光强度显著提升且降低了转化子数量，提升了筛选效率并有助于获得更高拷贝的菌株。对基因在酵母中过量表达基因和蛋白质有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。

背景技术

酿酒酵母是常用的真核微生物底盘微生物。在酿酒酵母中异源导入基因，可以用于化合物的合成或蛋白质的合成。但是，在酿酒酵母中一般只能导入质粒或者在基因组上进行整合表达，导入的质粒需要在选择性培养基中生长，并且容易丢失造成基因表达量的下降；而在基因组上整合表达虽然稳定，但是每次仅能整合一个拷贝，基因的表达强度不高。因此，需要开发一种可以在酿酒酵母基因上进行多拷贝整合的技术，又保证外源基因稳定性的同时，又能增加基因的表达强度。

酿酒酵母的基因组上存在Ty转座子序列，分为Ty1Cons、Ty2Cons、Ty3Cons、Ty4Cons和Ty5Cons，这些Ty转座子位点的两端存在一段约200bp左右的保守序列，并且每种Ty转座子在酿酒酵母基因组上都存在20-50个左右的拷贝。因此，将Ty转座子两端的保守作为同源臂，构建整合框，理论上经过一次转化，就可以在酿酒酵母基因组上实现多个拷贝的整合。为了增加工程菌株的整合拷贝数，需要对筛选标签的表达强度进行下调，使得仅当外源基因的整合拷贝数较高时，才能在筛选压力下生长，而整合拷贝数较低的菌株则无法生长或者生长较慢，以此达到筛选高拷贝工程菌株的目的。

氨基酸缺陷型是酿酒酵母转化时常用的筛选标签，其中，色氨酸缺陷型(TRP1-289)是由于色氨酸代谢通路中磷酸核糖基苯胺异构酶(phosphoribosylanthranilateisomerase，TRP1)发生单点突变，造成酿酒酵母无法正常合成色氨酸，只能从环境中摄取色氨酸。因此，在整合外源基因时，完整功能的TRP1可以用于筛选标签。但是TRP1用于高拷贝整合时，由于基因的表达强度较高，拷贝数较低的工程菌株也可以正常生长，从而难以筛选出高拷贝的工程菌株。而限制了其在筛选基因工程菌株中的应用。

发明内容

为了降低TRP1的表达强度，从而实现高拷贝菌株的筛选，本发明采用非常规起始密码子AAG和GUG替换TRP1的启动子AUG，显著降低了TRP1表达强度，其中，使用AAG替换AUG后的基因拷贝数高于GUG替换的情况。分别将AGG和GUG替换后的基因命名为TRP1_AAG和TRP1_GUG，将整合拷贝数较高的TRP1_AAG与4种Ty转座子的上下游保守序列组合后即获得了一组用于酿酒酵母多拷贝整合的工具包。工具包的适用范围广泛，可应用于各种酿酒酵母中，经过一次转化，即可实现酿酒酵母基因组的多拷贝整合，整合菌株的稳定性好，可用于基因的过量表达。

本发明基于公开号为CN113403334A的专利中公开的以TRP1为筛选基因的质粒pcT111、pcT112、pcT21、pcT31和pcT41为出发质粒，更换出发质粒中TRP1的起始密码子为AAG或GUG。

本发明的第一个目的是提供酿酒酵母基因表达框，所述表达框由弱启动子和带有降解标签deg的筛选基因组成；所述弱启动子包括P_ADE6，所述筛选基因为ScTRP1，将筛选基因ScTRP1的起始密码子替换为GUG或AAG。

在一种实施方式中，将起始密码子替换为AAG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将起始密码子替换为GUG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述降解标签deg的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。