[发明专利]利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用

权利要求书

1.利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法 ，其特征在于，通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因，筛选获得具有沉默效果的小发卡RNA序列，具有沉默效果的小发卡RNA序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3沉默的ROR1 CAR-T。

2.根据权利要求1所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因设计3种不同的小发卡RNA，先对Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成如下序列：

Tim3-siRNA-1 序列如SEQ ID No.1：GGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATT；

Tim3-siRNA-2 序列如SEQ ID No.2：GCCTCCCTGATATAAATCTAATT；

Tim3-siRNA-3 序列如SEQ ID No.3：GCAACCATCAGAATAGGCATCTACA。

3.根据权利要求2所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述Tim-3基因沉默的siRNA序列的对照为Tim3-siRNA-NC序列如SEQ IDNo.4 ：TTTGTACTACACAAAAGTACTG。

4.根据权利要求3所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，筛选获得Tim3-siRNA-3 序列如SEQ ID No.3：GCAACCATCAGAATAGGCATCTACA。

5.根据权利要求4所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述具有沉默效果的小发卡RNA序列为Tim-3-shRNA-3 序列如SEQ IDNo.5：

TGCAACCATCAGAATAGGCATCTACATTCAAGAGATGTAGATGCCTATTCTGATGGTTGCTTTTTT。

6.根据权利要求5所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括根据所述Tim-3-shRNA-3 序列设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC 序列如SEQ ID No.6：

TGGAAAGTTATTAGGTCTACCGTAGATTCAAGAGATCTACGGTAGACCTAATAACTTTCCTTTTTT。

7.根据权利要求1所述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法步骤为：

步骤1. Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成获得Tim3-siRNA-1 、Tim3-siRNA-2 、Tim3-siRNA-3及空白Tim3-siRNA-NC；

步骤2. 筛选对Tim-3基因沉默效率最高的siRNA，获得Tim3-siRNA-3；

步骤3. 构建pLL3.7-Tim-3-shRNA慢病毒转移载体

根据所述步骤2的siRNA沉默效率筛选结果，选择Tim-3-siRNA -3序列进行shRNA序列的设计并合成Tim-3-shRNA-3，同时设计合成阴性对照Tim-3-shRNA-NC；

步骤4. Lenti-TIM3-shRNA-NC和Lenti-TIM3-shRNA-3重组慢病毒制备；

步骤5.重组慢病毒对Tim-3基因沉默效率验证；

步骤6. pLL3.7-TIM3-shRNA-3-ROR1 CAR重组质粒构建（方法同步骤3）

步骤7. CAR-T细胞制备。