[发明专利]利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用

说明书

本发明提供了利用shRNA沉默人Tim‑3基因构建靶向ROR1的CAR‑T细胞的方法及其应用，本发明方法制备的HKP55 CAR‑T细胞能应用于癌症的治疗。本发明通过设计3种不同的小发卡RNA（shRNA）序列特异性的靶向Tim‑3基因，通过筛选获得沉默效果最好的shRNA‑3序列。因此，将shRNA‑3序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim‑3基因沉默的ROR1 CAR‑T（HKP55 CAR‑T）细胞。HKP55 CAR‑T细胞的Tim‑3表达水平极大的降低，与ROR1 CAR‑T（HKP69 CAR‑T）细胞相比较，Tim‑3基因的沉默显著增强了ROR1 CAR‑T细胞对高表达Galectin‑9的靶细胞的体外杀伤以及靶细胞依赖的细胞增殖。因此，HKP55 CAR‑T细胞能够克服复杂的免疫抑制性的肿瘤微环境，持续增殖并发挥抗肿瘤效应功能。

技术领域

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及CAR-T细胞。

背景技术

目前，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞治疗是近些年发展起来的一种靶向免疫细胞新疗法。CAR-T细胞在恶性血液肿瘤中取得了令人瞩目的成就，但是在实体肿瘤中的疗效仍然不够理想。其中一个主要原因在于实体肿瘤的免疫抑制性微环境及肿瘤细胞本身的免疫逃逸机制导致CAR-T细胞功能紊乱，无法发挥抗肿瘤免疫应答，但国内对通用CAR-T的研究与应用尚处于初步阶段。

T淋巴细胞免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin-domaincontaining-3，Tim-3)是一种跨膜蛋白，由Havcr2编码。最早发现于能够分泌IFN-γ的CD4+和CD8+效应T细胞。现在发现Tim-3在多种免疫细胞，如：B细胞、DC细胞、NK细胞、巨噬细胞中广泛表达。多项研究表明，Tim-3是抑制性免疫检验点分子，与其重要的配体之一Galectin-9相互作用可介导T细胞应答抑制和功能损伤，从而表现出耗竭状态。

发明内容

目前研究显示CAR-T细胞在体外活化和扩增过程中观察到Tim-3免疫检验点分子的表达水平显著提升。因此，CAR-T细胞进入含有大量肿瘤细胞来源的Galectin-9蛋白的肿瘤微环境中，其增殖能力和抗肿瘤应答能力将很大程度受到限制。

本发明中，通过设计3种不同的小发卡RNA(shRNA)序列特异性的靶向Tim-3基因，通过筛选获得沉默效果最好的shRNA-3序列。因此，将shRNA-3序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3基因沉默的ROR1 CAR-T(HKP55 CAR-T)细胞。HKP55 CAR-T细胞的Tim-3表达水平极大的降低，与ROR1 CAR-T(HKP69 CAR-T)细胞相比较，Tim-3基因的沉默显著增强了ROR1 CAR-T细胞对高表达Galectin-9的靶细胞的体外杀伤以及靶细胞依赖的细胞增殖。因此，HKP55 CAR-T细胞能够克服复杂的免疫抑制性的肿瘤微环境，持续增殖并发挥抗肿瘤效应功能。

需要说明的是本发明权利要求书中记载的方法在人体外进行，要保护的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法及其应用和本发明方法制备的HKP55 CAR-T细胞作为为癌症治疗药物这一用途，保护范围不包含任何疾病的治疗方法。

本发明提供了一种利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因，筛选获得具有沉默效果的小发卡RNA序列，具有沉默效果的小发卡RNA序列与靶向ROR1的CAR序列共转导入T细胞，制备出Tim-3沉默的ROR1 CAR-T。

根据上述的利用shRNA沉默人Tim-3基因构建靶向ROR1的CAR-T细胞的方法，本发明通过设计小发卡RNA序列特异性的靶向Tim-3基因设计3种不同的小发卡RNA，先对Tim-3基因沉默的siRNA序列设计和合成如下序列：

Tim3-siRNA-1序列如SEQ ID No.1：GGAGCCTGTCCTGTGTTTGAATT；