[发明专利]黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因及其应用在审
申请号: | 202210224009.5 | 申请日: | 2022-03-07 |
公开(公告)号: | CN115044693A | 公开(公告)日: | 2022-09-13 |
发明(设计)人: | 赵俊茗;马啸;杨建;雷雄;董志晓 | 申请(专利权)人: | 四川农业大学 |
主分类号: | C12Q1/6895 | 分类号: | C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 成都点睛专利代理事务所(普通合伙) 51232 | 代理人: | 李玉兴 |
地址: | 611130 四*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 黑药仲彬草 实时 荧光 定量 pcr 内参 基因 及其 应用 | ||
1.黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因,其特征在于:所述内参基因为Transcript-28482;所述Transcript-28482内参基因的cDNA序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析中的应用。
3.利用权利要求1所述的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析方法,包括如下步骤:
1)材料培养与处理:选取黑药仲彬草种子,经1%次氯酸钠消毒,无菌蒸馏水冲洗5遍后,将种子播于20×15×5cm塑料盆中,每盆1.5g,用石英砂覆盖,浇注1/2倍的霍格兰营养液,在昼夜温度分别为23℃和19℃、光周期12h、相对湿度75%、光照强度250umol·m-2·s-1的生长室中培养21天后,将黑药仲彬草植株分成三个处理组,将三个处理组的植株分别置于4℃的培养箱中进行冷胁迫、置于白天38/晚上33℃的培养箱中进行高温处理以及用20%浓度的PEG-6000进行干旱胁迫,分别在每个处理开始后0小时、12小时、24小时、48小时和96小时采集叶片样品,采集的样品立即在液氮中冷冻,并储存于-80℃的冰箱用于RNA的提取;
2)、黑药仲彬草总RNA的提取:采用RNA提取试剂盒提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并使用NanoDrop对提取的RNA进行纯度检测以及浓度的定量;
3)、cDNA的合成:合格样品采用Evo M-MLVRTMix试剂盒合成cDNA,储存于-20℃备用;cDNA的合成的具体步骤如下:
首先,在PCR管中配制反应液总量为20uL,反应过程如下:先在37℃下反应15min后,再85℃反应5s,之后保持在4℃;所述反转录反应液体系如表1所示:
表1 反转录反应液体系
4)、目标基因和内参基因的qRT-PCR反应:
使用2×SYBR Green Pro Taq HS Premix进行qRT-PCR,将内参基因和目标基因点在同一块PCR板上,反应在CFX96TM Real Time System荧光定量仪上进行,所述PCR反应体系如表2所示:
表2 PCR反应体系
扩增程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,60℃退火30s,40个循环,然后进行65~95℃溶解曲线分析,每个循环增加0.5℃,持续2-5s获得解链温度,采集溶解曲线荧光信号,Ct值数据由CFX96TM Real Time System荧光定量PCR仪自动读取;
5)、将获得的Ct值用2-△△Ct法计算相对表达量,具体步骤如下:
△Ct=Ct(目标基因)-Ct(内参基因)
△△Ct=△Ct(处理)-△Ct(对照)
2-△△Ct=相对表达量。
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