[发明专利]黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因及其应用

说明书

本发明公开了提供一种在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理下均能够稳定表达的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因。该内参基因比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好,稳定性高等优点,同时该内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，而现有的内参基因均无法实现在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理条件下均具有稳定的表达水平，因此，本发明所属的内参基因比现有的通用内参基因具有更好的校正能力，填补了黑药仲彬草研究领域中缺少合适的、通用的荧光定量PCR内参基因的空白,为今后黑药仲彬草以及其他小麦族植物基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。适合在内参基因领域推广运用。

技术领域

本发明属于内参基因领域，具体涉及一种黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因及其应用。

背景技术

黑药仲彬草(K.melanthera)属禾本科(Poaeeae)小麦族(Triticeae)仲彬草属(Kengyilia) 多年生异源六倍体自花授粉植物，主要分布于海拔3300-4750m的青藏高原干旱和半干旱的山坡、河谷、草原和草甸，对寒冷、干旱和盐碱等不良环境具有高度的适应性，可用于高原荒漠化防治和生态恢复，其具有较高的饲用价值，也可作为高原牧草。此外，研究发现黑药仲彬草对小麦赤霉病具有很强的抗性。这些优良特性，大都是麦类作物和牧草遗传改良中需要改进的性状，通过远缘杂交、染色体工程、基因工程等现代遗传和生物技术的方法将这些优良性状的基因转移到麦类作物和牧草的遗传背景中是完全可能的。因此，作为麦类作物和牧草育种的重要基因资源，黑药仲彬草具有重要意义。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复的动态定量范围和高通量等优点，是植物科学领域中研究基因表达水平的常用技术之一。然而，在其分析过程中RNA 的质量和产量、反转录效率的差异以及其它阻碍因素等都会对目的基因表达分析结果的准确性产生影响。因此需要选择合适的内参基因进行校正，从而减小检测样本之间的差异。理想的内参基因应该在各种条件下具有稳定的表达水平，例如不同组织、不同发育阶段以及各种生物和非生物胁迫。在植物qRT-PCR分析中，常见的内参基因包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)、延伸因子-1a(EF-1α)、泛素(UBQ)、肌动蛋白(ACTIN)、α-微管蛋白(TUA)、β-微管蛋白(TUB)、18S rRNA和亲环素(CYP)。而近年来的研究发现，这些常用内参基因在不同的环境条件、不同的发育阶段和组织器官中表达并不是恒定不变的。同时，不同植物有最合适的内参基因，而同一种植物不同组织之间内参基因的稳定性也存在差异，只能在一定的试验范围内相对稳定。当选择不适当的内参基因进行数据标准化时，往往会得到不正确的分析结果。因此，在特定实验条件下为特定物种选择表达稳定的内参基因对于目的基因表达水平分析至关重要。

然而，目前国内外尚无黑药仲彬草内参基因的报道，严重制约了其优异抗性基因的挖掘与利用。本发明基于全长转录组数据开发在不同非生物胁迫(干旱、高温和低温)处理下黑药仲彬草最稳定内参基因，并通过胁迫相关基因过氧化氢酶(CAT)进行了验证。旨在找到黑药仲彬草开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参基因，为今后探索和利用黑药仲彬草抗性基因奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理下均能够稳定表达的黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因，所述内参基因为Transcript-28482；所述Transcript-28482内参基因的cDNA序列如序列表 SEQUENCE ID NO.1所示。

本发明还发现了黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析中的应用。

本发明还提供了利用所述黑药仲彬草实时荧光定量PCR内参基因在黑药仲彬草干旱、高温和低温处理后基因表达分析方法，包括如下步骤：