[发明专利]基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法

说明书

本发明公开了一种基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法包括以下步骤：1)制备测试样品，采用磁性固相萃取方法进行样本中脂溶性维生素的前处理2)构建标准曲线3)采用液相色谱串联质谱法对测试样品进行检测。本发明提供的基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法，使用了磁性固相萃取方法进行样本中脂溶性维生素的前处理，基于基质分散型固相萃取，藉由外部磁场将磁性固相萃取填料进行转移，整个实验流程易于实现自动化；同时，还保留了固相萃取高选择性、高净化率等优点；本发明通过磁性固相萃取填料分散吸附增加接触面积，能提高吸附速率及富集效果，缩短平衡时间。

技术领域

本发明涉及质谱检测技术领域，特别涉及一种基于磁性固相萃取的脂溶性维生素的液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

维生素A是一种脂溶性维生素，对人体生长发育、维持正常身体机能、抵抗疾病等有重要作用，由视黄醇和长链脂肪酸结合而成的视黄酯是人体储存维生素A的主要形式。缺乏维生素A会导致夜盲症、生殖功能受损、免疫功能下降、骨代谢失常等生理机能损伤；而过量摄入维生素A会引起毒副作用。维生素D是一种脂溶性维生素，主要由维生素D2、维生素D3两种活性成分组成，维生素D在肝脏内被转化为25-羟基维生素D，临床上以25-羟基维生素D作为评价体内维生素D营养水平的指标。25-羟基维生素D是调节人体钙磷代谢的重要因子，协调骨钙的动员或沉积、尿钙的吸收或排泄，维持体内血钙水平的稳定，对骨骼发育、肌肉神经传导、信息传递等生命活动至关重要。儿童缺乏维生素D时表现为佝偻病，成人缺乏表现为骨软化、骨质疏松；维生素D过量则会引起钙的吸收增加，导致高钙血症。维生素E是一组以立体异构体存在的生育酚类物质，其中以α-生育酚活性最强，维生素 E是具有抗氧化功效的脂溶性维生素，它具有保护细胞膜完整性的重要功能，可预防动脉粥硬化，同时还能抑制平滑肌细胞增殖，增强一些酶的活性并抑制另一些酶的活性，从而达到调控目的基因的表达，长期缺乏维生素E会导致神经系统不正常，如肌肉共济失调、反射减退、失明及痴呆。综上，脂溶性维生素在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。合理的维生素水平对维持人体健康十分重要，准确测定人体中脂溶性维生素的含量，可以指导人们科学合理的补充维生素，预防疾病，提高生活质量，同时对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。

在临床质谱体外诊断试剂中，检测血清中脂溶性维生素常用方法有蛋白沉淀(PPT)、液液萃取法(LLE)、蛋白沉淀(PPT)+液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)，固相支持液液萃取法(SLE)等，其中蛋白沉淀+液液萃取法应用最为广泛，该方法具有成本低的特点，这种方法去除内源性干扰物的能力较差，容易堵塞色谱柱及污染质谱仪器，同时实验中使用了挥发性强的试剂，对实验人员存在健康隐患；例如专利：CN110779780A公开的一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法，其使用乙醇进行蛋白沉淀，并使用正己烷进行液液萃取、氮气吹干萃取液、样品复溶才可将样品进样分析，过程繁琐、需要大量人工操作，实验效率低下。达到。固相萃取法利用固相萃取填料与目标物的作用力，选择性吸附目标物，可以达到良好的净化效果，但固相萃取法使用的固相萃取柱/固相萃取96孔板均为高成本实验耗材，实验中固相萃取填料接触到有机试剂之后会产生溶胀现象，会影响溶液通过固相萃取填料的流速，从而产生孔间均一性差的问题；例如专利CN111198238A公开的血清中维生素D代谢物-25(OH)D3的萃取方法及检测方法，该方法首先对样品进行蛋白沉淀，然后再将沉淀的混合溶液上样至活性炭96孔板上，使用正己烷等强挥发试剂进行洗脱，氮气吹干洗脱液后进行样品的复溶，该方法在使用了高成本耗材的情况下操作步骤依旧繁琐，效率低下。而固相支持液液萃取法实验机理为液液萃取机理，产品形式为96孔板，同样也属于高成本的实验耗材，实验中需要使用大量挥发性强的有机试剂，对实验环境及人员均不友好，例如专利CN110763788A公开的高效液相色谱-串联质谱结合固相支持液液萃取法定量检测五种脂溶性维生素的方法。以上三种方法，还均存在一个共同的问题，即不便于实现全自动化样品前处理，不利于提高临床质谱样品前处理环节的工作效率。