[发明专利]基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法

权利要求书

1.一种基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的水下粘附水凝胶的制备方法，其特征在于，将重组蛛丝蛋白基因与阳离子多肽的基因融合后连接至表达载体pET28a4构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体导入表达宿主细胞中，经过发酵表达以及分离纯化后得到高纯度目的蛋白；再将高纯度目的蛋白的溶液与单宁酸溶液交联反应得到水下黏附水凝胶；

所述的重组蛛丝蛋白基因是指：金丝网蛛(Trichonephila clavipes)牵引丝蛋白MaSpI核心重复序列重复4、8、16、32和64次的蛋白，其中：MaSpI核心重复序列的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述的分离纯化，利用重组蛛丝蛋白的正电嵌段和负电的OmpF膜蛋白结合，将pH调节至该结合物的等电点Z使其沉淀粗纯，经漂洗后溶解于Buffer B中，利用Buffer B中PEI的强正电荷结合该负电杂蛋白OmpF使其沉淀，而重组蛛丝蛋白仍存在于上清中实现了进一步纯化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的构建是指：将合成的阳离子多肽基因通过限制性核酸内切酶BamHI HF和NcoIHF进行双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至表达载体pET28a4得到重组蛛丝蛋白的表达载体。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述的阳离子多肽包括：LL37、protamine多肽、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、富含赖氨酸、富含精氨酸、富含组氨酸等的带正电荷多肽。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述的LL37的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，即：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES，其密码子优化过后的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，即：5’-CTGCTGGGCGATTTCTTCCGCAAAAGCAAAGAAAAAATCGGCAAAGAATTCAAACGCATCGTTCAGCGCATCAAAGATTTCCTGCGCAATCTGGTTCCGCGCACCGAAAGC-3’；

所述的protamine多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，即：RSQSRSRYYRQRQRSRRRRRRS(来自数据库：NCBI)，其密码子优化过后的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示，即：5’-CGTAGCCAGAGCCGTAGCCGTTACTACCGTCAGCGTCAGCGTAGCCGTCGTCGTCGCCGTCGTAGC-3’。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的表达宿主为E.coliBL21(DE3)和E.coliBL21(DE3)plysS，所用的蛋白表达诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的分离纯化，具体包括：把表达有融合蛋白的大肠杆菌湿菌体以1：10质量体积比充分重悬于Buffer A中再通过高压匀浆仪高压800～1000bar压力破壁释放胞内物质；将破壁后的破菌液调节pH至Z，即融合了多肽Y的重组蛛丝蛋白与破菌释放的负电膜蛋白OmpF结合复合物的等电点，使用磁力搅拌器搅拌30min，随后离心弃上清取沉淀再重悬于Buffer A中，充分重悬洗涤重复3次，离心后将沉淀充分重悬于Buffer B中离心取上清，将上清进行硫酸铵沉淀，再将该沉淀重悬于蒸馏水中，离心取上清，最后若需要完全纯水溶解的蛋白可选用疏水柱过滤该上清取流出液。