[发明专利]基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法

说明书

一种基于蛛丝‑阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法，将重组蛛丝蛋白基因与阳离子多肽的基因融合后连接至表达载体pET28a4构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体导入表达宿主细胞中，经过发酵表达以及分离纯化后得到高纯度目的蛋白；再将高纯度目的蛋白的溶液与单宁酸溶液交联反应得到水下黏附水凝胶。本发明使用宿主本身的负电膜蛋白OmpF作为纯化介质，能够大量获得高纯度的融合蛋白，通过与单宁酸物理交联制成性能优良的水下粘附水凝胶，可批量纯化且降低成本。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法。

背景技术

在材料科学领域，制备具有水下高粘附性能的水凝胶材料一直是研究的热点和难点。天然高分子水凝胶如蛋白、壳聚糖、纤维素等由于其比化学高分子水凝胶具有更好的生物相容性及可调控的降解性因此备受关注。目前制备具水下粘附性能的天然高分子水凝胶的主流方法是通过化学枝接基团或物理掺合离子等手段对蛋白材料进行修饰，以创制出性能增强的蛋白水凝胶，但往往因稳定性不足且非天然修饰基团的生物相容性不足以致于限制了其应用范围。本发明利用基因工程和发酵工程技术直接生产出天然多肽修饰的融合蛋白而无需额外对水凝胶进行化学或物理修饰，避免了有细胞毒性的非天然组分并且解决了融合正电及疏水多肽的重组蛛丝蛋白难以用镍亲和层析纯化的问题，极大地方便了工业生产和使用，该方式制得的重组蛋白水凝胶可以实现常见材料例如铝、塑料和玻璃等以及组织器官表面快速，稳定的粘附性，尤其是水下环境的即时粘附，具有广阔的应用前景和价值。

发明内容

本发明针对现有基于天然高分子的粘附类水凝胶制备相对复杂，性能不稳定以及融合有阳离子肽段的重组蛛丝蛋白难以纯化或纯度不高的问题，提出一种基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的纯化及水下粘附水凝胶的制备方法，使用宿主本身的负电膜蛋白OmpF作为纯化介质，能够大量获得高纯度的融合蛋白，通过与单宁酸物理交联制成性能优良的水下粘附水凝胶，可批量纯化且降低成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于蛛丝-阳离子多肽融合蛋白的水下粘附水凝胶的制备方法，将重组蛛丝蛋白基因与阳离子多肽的基因融合后连接至表达载体pET28a4构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体导入表达宿主细胞中，经过发酵表达以及分离纯化后得到高纯度目的蛋白；再将高纯度目的蛋白的溶液与单宁酸溶液交联反应得到水下粘附水凝胶。

所述的重组蛛丝蛋白基因是指：金丝网蛛(Trichonephila clavipes)牵引丝蛋白MaSpI核心重复序列重复4、8、16、32和64次的蛋白，其中：MaSpI核心重复序列的氨基酸序列如 SEQ ID No.1所示。

所述的构建是指将合成的阳离子多肽基因通过限制性核酸内切酶BamHI HF和NcoI HF 进行双酶切后，通过T4 DNA连接酶连接至表达载体pET28a4得到重组蛛丝蛋白的表达载体。

所述的表达载体pET28a4是指：在市售pET28a(+)表达载体的多克隆位点修饰添加BamHI限制性酶切位点，其采用但不限于《大肠杆菌无膜隔室的形成和功能化》(Wei SP,Qian ZG,Hu CF,Pan F,Chen MT,Lee SY,XiaXX.“Formation and functionalization ofmembraneless compartments in Escherichia coli.”Nat Chem Biol,2020,16(10):1143-1148.)中记载的技术实现。

所述的阳离子多肽包括但不限于LL37、protamine多肽、多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚组氨酸、富含赖氨酸、富含精氨酸、富含组氨酸等的带正电荷多肽。

所述的LL37的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，即：