[发明专利]一种原代脊髓微血管内皮细胞的分离培养方法及由其得到的脊髓微血管内皮细胞

说明书

本发明提供一种原代脊髓微血管内皮细胞的分离培养方法及由其得到的脊髓微血管内皮细胞，所述方法包括如下步骤：（1）将脊髓组织与平衡盐溶液混合，进行研磨，离心，收集沉淀；（2）将步骤（1）得到的沉淀与富集试剂混合，离心，弃上清，得富集的脊髓微血管片段；（3）将得到的脊髓微血管片段与酶混合，消化，得脊髓微血管内皮细胞；（4）将脊髓微血管内皮细胞与增殖培养基混合，接种于蛋白质和/或多肽包被的细胞培养板上，进行一次培养，后换用选择培养基进行二次培养，即得。所述方法稳定性高、可重复性好、简便快速、成本低、得到的脊髓微血管内皮细胞纯度高且产量高，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞分离培养技术领域，涉及一种原代脊髓微血管内皮细胞的分离培养方法及由其得到的脊髓微血管内皮细胞。

背景技术

脊髓微血管内皮细胞（Spinal Cord Microvascular Endothelial Cells，SCMECs）是参与构成血脊髓屏障的重要细胞，血脊髓屏障不仅在脊髓稳态维持方面发挥着重要作用，越来越多研究还表明血脊髓屏障在中枢神经系统疾病的发生发展中也发挥着关键作用。脊髓微血管内皮细胞作为脊髓微环境内非常重要的细胞之一，从细胞水平深入探究脊髓微血管内皮细胞在脊髓生理病理微环境的关键作用，对于阐明脊髓相关疾病发病机理及开发对应治疗策略均具有重要意义。然而，遗憾的是当前并没有脊髓微血管内皮细胞相关的永生化细胞系在售。因此，构建一种原代脊髓微血管内皮细胞分离培养体系则显得异常重要。通过对脊髓微血管内皮细胞的深入研究将会进一步发现脊髓微血管内皮细胞相较于其他微血管内皮细胞的独特特点，以及该细胞在脊髓生理病理微环境中的关键作用。

目前现有技术中已经公开了多种脊髓微血管内皮分离培养方法，但都比较复杂且分离培养效果并不好，例如CN109234233A公开了一种血脊髓屏障OGD/R损伤模型及其构建方法和应用CN109142752A公开了一种紧密连接蛋白与致炎因子在血脊髓屏障损伤诊断中的应用。以上两个专利均采用机械破碎结合两次accutase酶消化的方法从24h新生的鼠提取脊髓微血管内皮细胞，耗时长，且无法有效实现从成体大鼠脊髓组织分离出脊髓微血管内皮细胞。当前已发表的期刊文献中多采用两步酶解法或者酶解法结合机械法的方式分离脊髓微血管内皮细胞，比如Watson等采用酶解结合离心的方式富集脊髓微血管片段，然后进一步酶解脊髓微血管片段分离脊髓微血管内皮细胞（Watson PM, Paterson JC, ThomG, Ginman U, Lundquist S, Webster CI. Modelling the endothelial blood-CNSbarriers: a method for the production of robust in vitro models of the ratblood-brain barrier and blood-spinal cord barrier. BMC Neurosci 2013, 14:59.），整个过程耗时多，所获细胞产量少并且易受微血管片段内其他杂细胞的污染；ShujunGe等采用注射器结合杜恩斯组织匀浆器通过机械法解离脊髓微血管片段，所获得的脊髓微血管片段通过dextran等方式富集并进一步酶解获得脊髓微血管内皮细胞（Ge S, PachterJS. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murinespinal cord. J Neuroimmunol 2006, 177(1-2): 209-214.），整个过程耗时且需要特殊的较为昂贵的杜恩斯组织匀浆器，且所需试剂繁多，易受杂细胞污染。

基于以上分析，当前已报道的专利或者期刊关于脊髓微血管内皮细胞分离培养所存在的问题主要有：分离培养过程中操作繁琐、需要特殊设备或者所需试剂种类多、细胞产量少且易受杂细胞污染等问题。

因此，如何提供一种操作简单、成本低、得到的细胞产量高且纯度高的脊髓微血管内皮细胞分离培养方法，成为了本领域亟待解决的问题。

发明内容