[发明专利]大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液及其分离方法

说明书

本申请属于生物技术领域，尤其涉及大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液及其分离方法。本申请提供了大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液，包括：第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液；其中，所述第一缓冲液包括4‑羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、RNA酶抑制剂和Hank's平衡盐溶液HBSS；所述第二缓冲液包括葡聚糖和第一缓冲液，所述葡聚糖的分子量为65000～75000；第三缓冲液包括动物血清和第一缓冲液。本申请提供了大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液及其分离方法，可有效解决现有技术纯化的大脑皮层血管纯度不高，提取的RNA纯度低，完整度低的技术问题。

技术领域

本申请属于生物技术领域，尤其涉及大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液及其分离方法。

背景技术

随着分子生物学的迅速发展，核酸的研究越来越多。而大脑皮层血管RNA被广泛应用于医学研究、尤其是临床诊断中。从大脑皮层血管样本中提取高质量的总RNA，是进行下游的测序、qPCR、芯片检测等技术的基础。但是，在大脑皮层血管中提取高质量的总RNA存在技术难点，RNA难以保存是基因表达组研究的一大瓶颈。RNA非常脆弱，极难保存，由于自然界广泛存在的RNA酶，包括组织内及病原体的RNA酶，使得RNA在室温几分钟内就开始降解，30分钟内完全降解成为检测不可用的小片段，限制了RNA的试验研究。

当前动物大脑皮层血管RNA纯化的方法主要是将大脑组织匀浆后通过不同孔径的筛网过滤分离微血管或者大血管组织，然后再提取组织RNA。但是现有技术方案纯化的血管组织普遍纯度不高，且常规方法中缺少对RNA保护的措施，获得的RNA结构不完整，质量差，无法进行后续的RNA测序。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液及其分离方法，可有效解决现有技术纯化的大脑皮层血管纯度不高，在其提取的RNA纯度低，完整度低的技术问题。

本申请第一方面提供了大脑皮层微血管和大血管RNA的纯化分离液，其特征在于，包括：

第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液；

其中，所述第一缓冲液包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、RNA酶抑制剂和Hank's平衡盐溶液HBSS；

所述第二缓冲液包括葡聚糖和第一缓冲液，所述葡聚糖的分子量为65000～75000；

第三缓冲液包括动物血清和第一缓冲液。

具体的，第二缓冲液中的葡聚糖用于控制溶液密度，当使用大于75000分子量的葡聚糖时，由于溶液密度大，通过离心沉淀的血管组织较少，分离效率低，且离心时间长；当使用小于65000分子量的葡聚糖时候，血管组织和其他组织成分如髓鞘不能分离。因此，使用分子量为65000～75000的葡聚糖，使分离出来的大脑皮层微血管和大血管组织结构完整，纯化的RNA分子结构完整，可以进行RNA测序。

具体的，所述葡聚糖的分子量为70000。

具体的，血管按照直径大小可分为毛细血管(小于10μm)、微血管(10-50μm)、大血管(大于50μm)。大脑皮层富含各种类型血管，分离纯化微血管和大血管目前是将大脑组织匀浆后可依次通过预置孔径的滤膜，得到大脑皮层微血管和大血管，如可依次通过100μm和20μm孔径的滤膜，冲洗获得的滤渣即为对应直径的血管(分别为大脑皮层微血管和大血管)。

另一实施例中，所述第一缓冲液中，所述Hank's平衡盐溶液HBSS为溶剂，所述HEPES和所述RNA酶抑制剂为溶质，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES的终浓度为1％～5％；所述RNA酶抑制剂的终浓度为0.1％～0.5％。

另一实施例中，所述第一缓冲液中，所述RNA酶抑制剂选自焦碳酸二乙酯DEPC、异硫氰酸胍和氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种。