[发明专利]一种副溶血弧菌基因高效敲除质粒的构建方法有效

申请号：	202210235371.2	申请日：	2022-03-11
公开（公告）号：	CN114606254B	公开（公告）日：	2023-08-25
发明（设计）人：	王小元;孟祥宇;王建莉;檀昕;周晴;黄丹阳;季帆	申请（专利权）人：	江南大学
主分类号：	C12N15/74	分类号：	C12N15/74;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/63
代理公司：	哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211	代理人：	赵巧娜
地址：	214122 江苏省无锡市滨***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	一种溶血弧菌基因高效质粒构建方法
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【权利要求书】：

1.一种敲除质粒pOTC，其特征在于，所述敲除质粒pOTC包含复制子p15A、抗性基因CmR、转移元件oriT和traJ、启动子Ptac、Cre基因；所述敲除质粒pOTC的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述敲除质粒pOTC中还含有SacB基因；所述SacB基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种敲除副溶血弧菌中目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）合成loxL-Gm-loxR片段，所述loxL-Gm-loxR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）将目的基因上下游同源臂同loxL-Gm-loxR片段整合到pDS132质粒上，得到重组质粒pDS132-1；

（3）将重组质粒pDS132-1导入大肠杆菌感受态中，得到重组大肠杆菌/ pDS132-1；

（4）将重组大肠杆菌/ pDS132-1同副溶血弧菌通过结合转导，得到含有重组质粒pDS132-1的重组副溶血弧菌/ pDS132-1，并将重组副溶血弧菌/ pDS132-1接种至含有含庆大霉素的蔗糖培养基中进行培养；

（5）将含有SacB基因的权利要求1所述的敲除质粒pOTC导入大肠杆菌感受态，得到重组大肠杆菌/pOTC-SB；将重组大肠杆菌/pOTC-SB与步骤（4）中培养后的重组副溶血弧菌通过结合转导后，接种至含有氯霉素的培养基中进行培养，得到敲除了目的基因的副溶血弧菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）和（5）中，所述大肠杆菌包括CC118 λpir、S17-1 λpir。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述含有庆大霉素的蔗糖培养基为LB培养基，所述蔗糖的添加量至少为：10%(w/v)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述庆大霉素的添加量为：10~30 mg/L。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有氯霉素的培养基为LB培养基，所述氯霉素的添加量为：6~30 mg/L。

7.如权利要求2~6任一所述的方法，其特征在于，所述目的基因为副溶血弧菌基因组上任一不影响其生长的基因。

8.权利要求1所述的敲除质粒在敲除副溶血弧菌基因组上任一不影响其生长的基因中的应用。