[发明专利]一种副溶血弧菌基因高效敲除质粒的构建方法

说明书

本发明公开了一种副溶血弧菌基因高效敲除质粒的构建方法，属于分子生物学和生物技术领域。本发明优化了敲除过程，引入Cre/loxP系统。在敲除同源臂之间加入了带有loxP位点的庆大霉素抗性片段，后该抗性片段通过Cre酶去除。第二次同源重组时加入庆大霉素，只有正确进行同源重组的菌株可以存活于10％蔗糖庆大抗性平板上，以此提高敲除菌株的筛选效率。再进行第二次结合转导，将带有cre基因的pOTC质粒导入副溶血弧菌。cre基因在细胞中表达Cre酶，识别loxP位点，并去除loxL与loxR之间的基因片段，即去除庆大抗性片段，在含有10％蔗糖的试管中去除pOTC质粒，本发明的方法提高正确菌株的筛选效率。

技术领域

本发明涉及一种副溶血弧菌基因高效敲除质粒的构建方法，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

副溶血弧菌传统敲除流程为：将同源臂连接到自杀质粒上，通过接合转导进入细胞并同源重组整合到基因组上。其次在10％蔗糖的环境中，整合到基因组的质粒上的sacB会分解蔗糖产生致死物质，由此迫使细胞发生第二次同源重组去掉质粒。第二次同源重组会出现两种情况，第一种为同源重组发生的位置与第一步不同，即第一步与第二步的同源重组分别发生在上游/下游同源臂上，这样在去掉质粒的同时，目的基因片段也会随之去除，敲除成功；第二种情况为同源重组发生的位置与第一步相同，即第一步与第二步的同源重组发生在同一个同源臂上，结果为整合在基因组上的质粒原封不动的被去除掉，敲除失败。随着目的基因在细胞中的重要性不同，敲除的难易程度也会随之改变。在某些基因的敲除过程中，第二步会花费大量的时间和资源。

并且，sacB基因容易发生突变，其反向筛选的假阳性率高，所以最后需要应对大量突变株进行鉴定，花费大量的时间和资源。因此，急需一种准确率高的副溶血弧菌的敲除方法。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明优化了敲除过程，引入Cre/loxP系统。在敲除同源臂之间加入了带有loxP位点的庆大霉素抗性片段，后该抗性片段通过Cre酶去除。第二次同源重组时加入庆大霉素，只有正确进行同源重组的菌株可以存活于10％蔗糖庆大抗性平板上，以此提高敲除菌株的筛选效率。再进行第二次结合转导，将带有Cre基因的pOTC质粒导入副溶血弧菌。Cre基因在细胞中表达Cre酶，识别loxP位点，并去除loxL与loxR之间的基因片段，即去除庆大抗性片段。最后在含有10％蔗糖的试管中去除pOTC质粒。

本发明提供了一种敲除质粒pOTC，所述敲除质粒pOTC包含复制子p15A、抗性基因CmR、转移元件oriT和traJ、启动子Ptac、Cre基因；所述敲除质粒pOTC的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述敲除质粒pOTC中还含有SacB基因；所述SacB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种敲除副溶血弧菌中目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)合成loxL-Gm-loxR片段；

(2)将目的基因上下游同源臂同loxL-Gm-loxR片段整合到pDS132质粒上，得到重组质粒pDS132-1；

(3)将重组质粒pDS132-1导入大肠杆菌感受态中，得到重组大肠杆菌/pDS132-1；

(4)将重组大肠杆菌/pDS132-1同副溶血弧菌通过结合转导，得到含有重组质粒pDS132-1的重组副溶血弧菌/pDS132-1，并将重组副溶血弧菌/pDS132-1接种至含有含庆大霉素的蔗糖培养基中进行培养；

(5)将含有SacB基因的上述敲除质粒pOTC导入大肠杆菌感受态，得到重组大肠杆菌/pOTC-SB；将重组大肠杆菌/pOTC-SB与步骤(4)中培养后的重组副溶血弧菌通过结合转导后，接种至含有氯霉素的培养基中进行培养，得到敲除了目的基因的副溶血弧菌。