[发明专利]HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞、其制备方法及其应用

权利要求书

1.HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，能够同时表达HER2和IL-12，通过HER2靶向肿瘤细胞，并自分泌IL-12增强抗肿瘤能力；

所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞通过将IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞，然后经过检测与鉴定试验制备得到。

2.根据权利要求1所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，所述IL-12慢病毒中包含人工合成的IL-12基因，所述人工合成的IL-12基因是将人的天然IL-12基因的p35亚基基因和p40亚基基因通过连接肽基因连接后得到，所述人工合成的IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述HER2-CAR慢病毒包含人工合成的HER2-CAR基因，所述人工合成的HER2-CAR基因是将从NCBI数据库获得的人CD8α信号肽基因、靶向HER2单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4-1BB的胞内区基因以及人CD3ζ胞内信号肽基因序列连接后经密码子优化得到，所述人工合成的HER2-CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞，其特征在于，其HER2-CAR阳性率在5％～85％之间，所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞稳定传代期间上清液中IL-12含量在1-10ng/ml之间，IFN-γ含量在1～10ng/ml之间。

4.根据权利要求1-3所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

慢病毒表达载体构建：将人工合成的IL-12基因和人工合成的HER2-CAR基因分别连接到慢病毒载体质粒I和慢病毒载体质粒II上，构建得到IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体；

慢病毒表达载体包装：将所述IL-12慢病毒表达载体和HER2-CAR慢病毒表达载体分别与包装质粒共转染293T细胞，培养一段时间后，再经收集、浓缩处理，得到IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒；

HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞构建与鉴定：培养传代NK-92细胞，将所述IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒分别按照一定的MOI值共同感染NK-92细胞，培养收集细胞，再经HER2-CAR阳性率检测、细胞因子含量检测以及体外杀伤试验鉴定后，最终得到所述HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞。

5.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体质粒I和质粒II选自PGMLV质粒、lenti质粒、pCDH质粒、pLVX质粒或pRRLSIN质粒。

6.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体包装步骤中，所述IL-12慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml，HER2-CAR慢病毒的滴度为(1-10)×10⁸TU/ml。

7.根据权利要求4所述的HER2靶向的增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其特征在于，培养传代NK-92细胞、IL-12慢病毒和HER2-CAR慢病毒共同感染NK-92细胞后的细胞培养所用培养基为完全培养基，培养条件均为于37℃，5％CO₂培养箱中，按照1.5×10⁵cell/ml密度培养2-3天传代一次；

其中，所述完全培养基包括以下组分：

Alpha MEM培养基、10％～15％马血清、10％～15％胎牛血清、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM叶酸以及50-200U/ml IL-2。