[发明专利]一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用

说明书

本发明提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用，本发明使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的蛋白酶基因进行突变，再通过高通量筛选，获得蛋白酶突变体BLAPR1，相比于未突变的蛋白酶，本发明得到的蛋白酶突变体的热稳定性得到显著提高，具有良好的市场应用前景和工业价值。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用。

背景技术

蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，有着许多不同的生理功能，是酶学研究开展的较早，也是最为成熟的一种。蛋白酶在各个领域中的应用愈加广泛，例如食品工业、酿酒酿造、洗涤剂行业、饲料工业、制革工业、丝绸行业和医药行业等，与我们的生活息息相关，这种环境下对蛋白酶的产量和特性改良方面都提出了更高的要求。

目前市场上大多数蛋白酶70℃处理后仅剩余酶活20%不到，总体耐温性能差，限制了蛋白酶的广泛使用。例如在饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活。因此提高蛋白酶的热稳定性至关重要。

易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件，增加扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，从而筛选需要的正向突变体。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

发明内容

本发明提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1及其编码基因和应用，通过构建突变体文库和定向筛选的方法，对 Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因进行改良，筛选得到热稳定性提高的突变体，借此有助于提升其在饲料、食品或洗涤领域中的应用效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种热稳定性提高的蛋白酶突变体BLAPR1，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了包含所述蛋白酶突变体编码基因的重组表达载体。

本发明提供了包含所述蛋白酶突变体编码基因的的基因工程菌，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌。

本发明提供了所述蛋白酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

1）重组基因工程菌构建：将所述蛋白酶突变体的编码基因连接到pUB110载体上，再将重组载体转化入枯草芽胞杆菌中，利用抗性标记筛选阳性克隆；

2）重组基因工程菌摇瓶发酵：将验证正确的阳性克隆接种到摇瓶中发酵，震荡培养，发酵产生蛋白酶突变体；

3）重组菌株放大发酵：将表达蛋白酶突变体的基因工程菌株接种到发酵罐中，从而发酵产生蛋白酶突变体BLAPR1。

进一步的：所述步骤（3）发酵培养基包括以下成分：豆粕5-10%、玉米粉1-5%、PPG-20000 0.1-1.0%、蛋白酶0.1-1.0%、淀粉酶0.1-1.0%、磷酸氢二钠0.2-0.5%，以质量比计。

本发明提供了所述蛋白酶突变体在用于制备饲料添加剂、食品添加剂和洗涤剂中的应用。