[发明专利]一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种肿瘤微环境调控型CAR‑单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，属于免疫学和肿瘤治疗学技术领域。所述CAR‑单核/巨噬细胞形成嵌合抗原受体复合结构的同时，可胞内表达GM‑CSF并自分泌至胞外，促进CAR‑单核/巨噬细胞形成M1型巨噬细胞分化，保持自身抗肿瘤微环境M2型逆转的同时，可进一步调控肿瘤微环境，进而增敏CAR‑单核/巨噬细胞的抗肿瘤效应。本发明基于GM‑CSF构建了肿瘤微环境调控型的CAR巨噬细胞技术平台，能够维持CAR‑M自身的M1型特性，又能产生TME逆转效应，进而实现CAR‑单核/巨噬细胞的高效抗肿瘤效应。

技术领域

本发明涉及免疫学和肿瘤治疗学技术领域，特别是涉及一种肿瘤微环境调控型CAR-单核/巨噬细胞及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，肿瘤细胞免疫疗法功能被广泛应用于各种恶性肿瘤的实验研究和临床治疗，尤其是CAR-T细胞免疫疗法在血液系统肿瘤领域取得很好的疗效。但在实体肿瘤中，抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)通常会通过多种因素对过继细胞免疫治疗形成免疫壁垒，其致密的细胞和基质屏障首先对工程淋巴细胞浸润实体肿瘤形成物理屏障。即便是进入实体肿瘤，TME形成的免疫抑制微环境，如缺氧和酸性环境、免疫检查点配体的表达、特别是大量的免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞 (tumor-associatedmacrophage，TAM)、髓系来源的抑制细胞和调节性T细胞，形成的免疫抑制屏障是当前实体肿瘤免疫治疗的主要难点之一。

TME形成的免疫抑制机制十分复杂，这其中重要的因素，即为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)形成的免疫抑制机制。肿瘤通过各种可溶性和机械因素将循环中的单核细胞和组织驻留的巨噬细胞招募到TME，并将它们极化成M2 表型，从而产生TAM。TAM相对于生理条件下的巨噬细胞，对肿瘤细胞的免疫识别和吞噬能力发生显著性改变，失去了对异常细胞识别并免疫清除的基本免疫功能。同时， TAM还通过上调免疫抑制表面蛋白，分泌活性氧，产生抑制T细胞功能的细胞因子，以及分泌招募Treg细胞的趋化因子，在抑制内源性抗肿瘤免疫中发挥关键作用。此外， TAM通过分泌VEGF和基质金属蛋白酶等因子来促进肿瘤血管生成和转移，这些因子可以重塑TME，增加血管形成，促进肿瘤细胞迁移。由于巨噬细胞极化是一个渐进变化过程，随着肿瘤微环境抑癌信号的增加，TME可能将更多趋化至实体瘤内部的巨噬细胞从M1表型转变为M2样TAM表型。随着肿瘤恶性程度的增加，实体瘤内TAM 会达到50％，并且继续增多。

针对TAM的免疫抑制特性，当前一部分临床免疫治疗，采取抑制巨噬细胞向实体肿瘤趋化、杀灭巨噬细胞数量、诱导M2型巨噬细胞向M1型复极化或者促进TAM重编程为M1型等不同策略。有研究通过阻断CSF1(也称为MCSF)/CSF1R轴，这是巨噬细胞分化和存活的重要配体-受体对，从而阻断单核细胞分化来减少TAM的数量，同时也降低了现有TAM的存活率。此外，有研究使用CSF1R的小分子抑制剂阻断诱导 TAM从M2向M1表型的复极化，使TAM具有抗肿瘤作用。这些策略仍着眼于对TAM 的数量改变的治疗水平。

针对实体肿瘤的免疫治疗难点，嵌合抗原受体巨噬细胞免疫治疗(CAR-Macrophage， CAR-M)是作为近年来发展的新颖的过继细胞免疫治疗技术，采用单核/巨噬细胞进行 CAR构建，为攻克实体肿瘤提供了一种可能的解决方案。CAR-M细胞可特异地向实体瘤集聚，并穿透肿瘤周围致密的间质组织。此外，CAR-M将直接杀瘤手段与通过抗原提呈增强内源性免疫的能力结合在一起，使其成为抗肿瘤细胞治疗发展的独特途径。研究发现，CAR-M能够在不添加可溶性调理因子的情况下驱动对靶肿瘤细胞的吞噬和杀伤。Morrissey等发现，利用抗CD19和抗CD22 CAR构建小鼠巨噬细胞系和小鼠骨髓来源的巨噬细胞，介导了对抗原珠和肿瘤细胞的吞噬作用，证实了CAR诱导吞噬途径的能力。Zhang等利用诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)表达 CAR，并将CAR-iPSCs诱导为CAR-iMac。在没有抗原刺激的情况下，CAR-iMac偏向 M2样表型。在抗原刺激后，CAR介导的信号促进CAR-iMac的吞噬作用。