[发明专利]一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒

说明书

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒。针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中醛固酮时，所需样品量大(≥500μL)，特异性不足，检出限难以突破导致的血浆中游离醛固酮检测领域处于空白的技术问题，本申请提供一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，仅需300μL血浆即可对血浆中游离醛固酮进行检测。本申请还提供了一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法，依次使用超滤法分离，液液萃取法提取，再通过高效液相色谱串联质谱检测，可使定量下限达到0.05pg/mL，测试结果的准确度和精密度较好，操作快速简便。

技术领域

本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种测定血浆中游离醛固酮含量的方法及试剂盒。

背景技术

醛固酮是最重要的盐皮质激素类固醇激素，在维持血管内体积和电解质平衡方面发挥重要作用。最近的研究发现醛固酮在其他方面也有着不容忽视的调节作用，如在上皮钠通道的表达、炎症、代谢综合征和高血压、胰岛素抵抗、心血管和肾纤维化等疾病。醛固酮的测定可用于心血管疾病、肝硬化、肾脏疾病(肾上腺偶发瘤、肾上腺癌、艾迪生病、先天性肾上腺增生、肾动脉狭窄和肾小管通道病等)、胰岛素抵抗和糖尿病等疾病的调查。醛固酮的准确测定对于原发性醛固酮增多症的筛查、诊断和亚型分类至关重要。原发性醛固酮增多症是一种严重且经常被漏诊的继发性高血压，主要由产生醛固酮的腺瘤或由双侧肾上腺增生引起的特发性醛固酮增多症引起，原发性醛固酮增多症患病率在3～32％之间，并且醛固酮分泌过高伴随着严重的心、脑等靶器官损伤，因此，原发性醛固酮增多症的早期识别至关重要，这依赖于醛固酮的准确测定。

血浆类固醇测定是肾上腺疾病临床评估的主要工具之一，血浆中游离醛固酮的含量很低，浓度在pmol/L级别，因此需要高灵敏的醛固酮测定方法。传统上，醛固酮的测定方法主要为放射免疫测定法和自动化化学发光免疫测定法，前处理方法较为简单但方法特异性不足，因为免疫测定容易受到交叉反应物(如其他类固醇激素及结构类似物)或其他干扰物质的干扰，容易造成检测结果的假阳性或假阴性，准确度和精密度较差，同时存在醛固酮竞争性免疫测定之间的方法依赖性偏差问题而导致不同免疫法的测定结果无法直接对比等问题，不利于临床实验的长期追踪以及相互比对。

目前关于体内测定游离醛固酮的文献报道较少，通常测定总醛固酮，一般采用气相色谱-质谱法或液相色谱-串联质谱法，其中气相色谱-质谱法方法在分析之前需要经过费时费力的衍生化前处理步骤。中国专利申请公布号CN113049697A，发明名称为“同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒”，公开了的方法包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；采用液相色谱串联质谱方法进行检测。该方案优化前处理过程，采用10～100mM的乙酸铵为pH值调节剂，降低其在待测溶液中的质子化解离，提高其在SPE处理中的回收率，提高了物质的检测灵敏度，但依然仅能对总醛固酮进行检测。

游离醛固酮更能代表体内具有生物活性醛固酮水平，醛固酮由肾上腺上皮细胞分泌，主要以蛋白结合态醛固酮和游离态醛固酮存在于血浆中，其中血浆游离态醛固酮的比例在25～40％之间，因此，要求分析方法的灵敏度极高。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中醛固酮时，所需样品量大(≥500μL)，特异性不足，检出限难以突破导致的血浆中游离醛固酮检测领域处于空白的技术问题，本申请提供一种测定血浆中游离醛固酮含量的试剂盒，仅需300μL血浆即可对血浆中游离醛固酮进行检测。本申请还提供了一种检测血浆中游离醛固酮含量的方法，依次使用超滤法分离，液液萃取法提取，再通过高效液相色谱串联质谱检测，可使定量下限达到0.05pg/mL，测试结果的准确度和精密度较好，操作快速简便。

2、技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：