[发明专利]一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用试剂盒。本发明成功建立了双重数字PCR检测miR‑891a‑5p与内参基因RNU6b的体系，从而获得了基于数字PCR技术的准确、灵敏的精液检验方法，能够实现精液的100％准确鉴别，混合斑、微量精液、模拟案件精斑样本均被准确判定。因此，本发明具有很好的应用前景，有望在法医实际案件中进行广泛应用。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于法医学领域，具体涉及一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用试剂盒。

背景技术

准确确定案发现场遗留的体液斑迹组织属性对于确定案件性质、重建犯罪现场等具有重要意义，而精斑是法医案件中常见的生物物证，尤其是强奸、猥亵等案件，对其准确定性至关重要。传统的精斑检验方法包括化学法、酶催化法、光谱法和免疫学法等，具有对检材完整性要求高、灵敏度和特异性各异、检验结果不稳定且影响后续DNA检测等局限性。MicroRNA(miRNA)是一种长度为18-25个碱基的非编码小分子RNA，具有高稳定性、强保守性、良好的组织特异性、可兼容DNA同步分析等优势，是法医体液鉴定的重要工具。

一直以来，实时定量PCR(RT-qPCR)被认为是检测miRNA表达定量的金标准，也是目前基于miRNA进行体液鉴定的主流检测方法，但该方法需要科学准确地选择内参基因进行相对定量分析或通过已知浓度的标准品制作标准曲线以进行绝对定量。另一方面，qPCR针对不同的目标基因需要设计单独的检测体系，复合检测难度较大，无形中限制了其在法医实践中的广泛应用。大量研究表明，miR-891a-5p具有良好的精液特异性，但目前使用的检测方法均为RT-qPCR相对定量法，存在一定的假阳性和假阴性概率，且不同研究可重复性和一致性较差。

数字PCR是近些年逐渐发展成熟的一种可对微量核酸样本进行绝对定量检测的方法，其原理是将待测样本分成数万个微滴，每个微滴不含或含有至少一个待检核酸靶分子，经过独立PCR反应后，逐个对每个微滴进行检测，最终根据泊松分布原理及阳性微滴比例，给出待检靶分子的拷贝浓度。数字PCR是一种高灵敏度、高精确性的定量方法，尤其对于低浓度核酸分子检测结果可重复性好，可用于miRNA的绝对定量检测。与qPCR相比，数字PCR对PCR抑制剂的耐受能力更强，对PCR效率的依赖性更小，并可进行多重检测。然而，迄今为止，数字PCR技术尚未引入法医学体液鉴定领域。

此外，目前大多数研究仅使用新鲜制备的实验室样本进行检测和分析，但考虑到法医实际工作的特殊性和法医相关检材的复杂性，犯罪现场遗留的体液斑迹往往具有微量、降解的特点，且有可能与其他体液不同程度混合。因此，混合斑以及微量、降解样本的检测一直是法医体液鉴定的重点和难点，迫切需要一种准确、灵敏、高效的精斑检验技术。

发明内容

本发明的目的为准确、灵敏、高效的鉴定精液或精斑。

本发明首先保护一种用于鉴定精液的试剂盒，可包括引物对891、逆转录引物891、水解探针891、引物对RNU6b、逆转录引物RNU6b和水解探针RNU6b；

引物对891可由正向引物-891F和反向引物-891R组成；

水解探针891的5′末端具有荧光标记甲，3′末端具有非荧光淬灭基团；

引物对RNU6b可由正向引物RNU6b-F和反向引物RNU6b-R组成；

水解探针RNU6b的5′末端具有荧光标记乙，3′末端具有非荧光淬灭基团；

所述逆转录引物891的核苷酸序列可如SEQ ID NO：2所示；

所述正向引物-891F的核苷酸序列可如SEQ ID NO：3所示；

所述反向引物-891R的核苷酸序列可如SEQ ID NO：4所示；

所述水解探针891的核苷酸序列可如SEQ ID NO：5所示；