[发明专利]于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，所述污染条件包括肠道以活菌计数计包含细菌数不低于10⁵cfu/m³、以及所述方法实施环境中采用GB/T16293-2010《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》检测浮游微生物不低于10⁴cfu/L，所述方法包括以下步骤：

得到去除组织周围的结缔组织和脂肪的肠道组织块；

将所述肠道组织块用0.05～0.25％胰酶消化处理，并用完全培养液终止消化，以得到组织消化液；

将所述组织消化液依次通过100μm细胞滤器和70μm细胞过滤器，离心，第一细胞沉淀；

将所述第一细胞沉淀用样本稀释液重悬至浓度为2×10⁸～1×10⁹个/mL，进行密度梯度离心，即可得到第二细胞沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对所述肠道组织块进行消化的处理条件为温度-4～40℃，消化0-3h；在对所述组织消化液过滤后的离心条件为400～500g离心10～15min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本稀释液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述样本稀释液的pH 7.2～7.5；

所述完全培养基为包含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对第二细胞沉淀进行鉴定的步骤具体包括：

将所述第二细胞沉淀用样本稀释液重悬后，400～500g离心10～15min，弃上清；

加入0.5～1.0mL 4℃预冷的固定剂，室温或37℃孵育5～30min；

400～500g离心10～15min，弃上清；

加入预冷PBS洗涤；

加入1.0～3.0mL破膜剂室温或37℃孵育5～15min，400～500g离心10～15min，弃上清；

加入0.1～1.0mL重悬液后，完成细胞计数；

加1～10μL浓缩型血清，37℃孵育5～30min，洗涤；

加入KRT8抗体室温或37℃孵育30～120min，400～500g离心10～15min，弃上清，加1mLPBS重悬清洗2次；

加入荧光二抗，37℃避光孵育30～60min，400～500g离心10～15min，弃上清，加1mLPBS清洗2次，弃上清，加0.1mL PBS，混匀，最后上机检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述肠道组织块进行冻存与复苏的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述肠道组织块进行冻存的步骤具体包括：

将所述肠道组织块装入冻存管中，加入冻存液，封口，置于4℃冰箱30min，随后放入-20℃冰箱1.5h，最后放入-80冰箱保存；

对所述肠道组织块进行复苏的步骤具体包括：将细胞冻存管从-80℃冰箱取出后迅速至于37℃水浴锅中，并摇动冻存管，使之迅速融化，取出组织块，用PBS缓冲液清洗干净，用于后续上皮细胞的分离、纯化及鉴定。

其中，所述PBS缓冲溶液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述PBS缓冲液的pH为7.2～7.5。

其中，所述细胞冻存液为无血清细胞冻存液或含有10％二甲基亚砜、90％胎牛血清的混合溶液。