[发明专利]于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法

说明书

本申请公开了一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，污染条件包括肠道包含细菌数不低于10⁵cfu/m³以及所述方法实施环境中浮游微生物不低于10⁴cfu/L，该方法包括对肠道组织块进行消化、密度梯度离心得到纯化的上皮细胞步骤。本申请适用于不同年龄阶段和生理状态的不同种属动物(新生和已采食动物均可)肠道上皮细胞的分离纯化，且无需控制和使用无菌提取条件及细胞传代纯化技术，操作方法快速、简便、高效，所用仪器设备为实验常规仪器设备，成本低廉，在医学、动物学、营养学等领域的研究以及试剂盒的研发等具有重要的指导意义。

技术领域

本申请涉及肠道上皮细胞分离技术领域，尤其涉及一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，适用于不同年龄阶段和生理状态的不同种属动物(新生和已采食动物均可)现场有菌条件下获取肠道上皮细胞。

背景技术

肠道上皮细胞是肠道主要功能性细胞，在肠道营养物质消化吸收、构成肠道免疫屏障抵御细菌等病原体的入侵以及应急反应中均发挥着重要的作用。由于肠道经常经受食物和药物等等异物的刺激，其微环境中存在着强大的抗感染生物因素。由于受这种特殊的生长条件限制，肠道上皮细胞原代培养较难。

现有技术对于肠道上皮细胞的分离纯化方法主要有酶消化法和组织块，这些方法虽然能提成和分离得到上皮细胞，但是这些操作过程较为繁琐，耗时较长，获取细胞纯度和活细胞数量较低，并且对于一些有污染的肠道或者已经产生肿瘤的肠道，其提取和分离得到的上皮细胞纯度不够，无法满足对于其继续传代培养的要求。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于建立一种快速、简便、高效，且适用于污染条件下的肠道上皮细胞的分离纯化，在医学、动物学、营养学等领域的研究以及试剂盒的研发等具有重要的指导意义。

本发明的发明人深入研究比较了国内外不同种属动物肠道上皮细胞分离、纯化、以及原代培养等多种方法，通过大量的实验摸索，发明了适用于不同种属动物(不同年龄，不同生理阶段)肠道上皮细胞的分离纯化方法，适合现场有菌条件下提取，更能反映出肠道上皮细胞机能的实际情况，为动物肠道上皮细胞的结构、发育以及物种进化等研究奠定基础。此方法可应用于大鼠、猪、鸡、鸭、鹅、狗、骆驼、牛、马、羊、兔、猴、虎、猫、熊猫、人等肠道上皮的提取、分离及纯化。

为了达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本申请实施例公开了一种于污染条件下分离肠道上皮细胞的方法，所述污染条件包括肠道以活菌计数计包含细菌数不低于10⁵cfu/m³、以及所述方法实施环境中采用GB/T16293-2010《医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法》检测浮游微生物不低于10⁴cfu/L，所述方法包括以下步骤：

得到去除组织周围的结缔组织和脂肪的肠道组织块；

将所述肠道组织块用0.05～0.25％胰酶消化处理，并用完全培养液终止消化，以得到组织消化液；

将所述组织消化液依次通过100μm细胞滤器和70μm细胞过滤器，离心，得到第一细胞沉淀；

将所述第一细胞沉淀用样本稀释液重悬至浓度为2×10⁸～1×10⁹个/mL，进行密度梯度离心，即可得到第二细胞沉淀。

在本申请实施例中，在对所述肠道组织块进行消化的处理条件为温度-4～40℃，消化0-3h；在对所述组织消化液过滤后的离心条件为400～500g离心10～15min。

在本申请实施例中，所述样本稀释液包含8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、41.44g/L磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，所述样本稀释液的pH 7.2～7.5；所述完全培养基为包含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12培养基。