[发明专利]一种基于双滚环分离检测外泌体的光学生物传感器

说明书

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于双滚环分离检测外泌体的生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ NO:1‑10所示的模板CT1，模板CT2，Connector，DNA‑chol，CP1，CP2，发夹探针H1，发夹探针H2，Reporter，crRNA，和Cas12a、T4 DNA连接酶；所述DNA‑chol的3’端修饰胆固醇；所述Reporter的5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于双滚环分离检测外泌体的生物传感器及其制备方法。

背景技术

外泌体是一种直径为30~100 nm、密度为1.10~1.18 Kg/L的由细胞分泌的膜性囊泡小体。外泌体能够与受体细胞结合，参与细胞间物质交换和信息交流。外泌体中所含有的与肿瘤相关的蛋白，核酸，小分子等，都有潜力成为潜在的生物标志物。肿瘤细胞分泌的外泌体的含量在血液中的含量很高，每毫升血液中含有超过10⁹个外泌体，以利用外泌体作为生物标志物进行检测会有更高的灵敏度，有助于癌症的早期检测。常见的检测外泌体的方法包括Wsetern blot、ELISA等，但这些方法的操作太过繁琐，限制了快速检测外泌体的应用。因此急需一种简单快速的分析方法来对外泌体进行检测。

CRISPR-Cas作为一种自适应免疫系统，近年来被发现Cas12a在特异性识别DNA之后表现出非特异性降解即反式切割的活性，有望成为快速、准确的诊断工具。近几年，DNA生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注，尤其其中的光生物传感器具有灵敏度高、价格低廉等的优势。

发明内容

针对现有方法中的操作过程繁琐、价格昂贵等的问题，提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于CRISPR系统的检测外泌体的生物传感器。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于双滚环分离检测外泌体的生物传感器，包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-10所示的模板CT1，模板CT2，Connector，DNA-chol，CP1，CP2，发夹探针H1，发夹探针H2，Reporter，crRNA，和Cas12a、T4 DNA连接酶；

所述DNA-chol的3’端修饰胆固醇；

所述Reporter的5’端和3’端分别连接荧光报告基团和荧光猝灭基团。

优选地，所述滚环模板CT1、滚环模板CT2和T4 DNA连接酶用RCA1和RCA2代替，所述RCA1和RCA2的序列如SEQ ID NO: 12-13所示。

一种包含上述生物传感器的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括缓冲溶液。

一种上述生物传感器或试剂盒检测外泌体的方法，包括以下步骤：

（1）将滚环模板CT1和滚环模板CT2分别与primer混合在T4 DNA连接酶催化下制备滚环1和滚环2；

（2）将滚环1或滚环2在phi29聚合酶催化下以dNTP为底物制备RCA1或RCA2；

（3）将RCA1、RCA2、待测样品或外泌体标准品、DNA-chol、Connector混合，调节pH至6.0；然后加入发夹探针H1、发夹探针H2、Cas12a、crRNA和Reporter，混合均匀后孵育，检测荧光。

所述primer的序列如SEQ ID NO: 11所示。