[发明专利]一种联合检测miRNA155和谷胱甘肽的荧光生物传感器

说明书

本发明属于生物检测技术领域，提供了一种联合检测miRNA和GSH的荧光生物传感器，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示的连接探针L、挂锁探针P、H1和报告探针H，Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP和GSH；所述挂锁探针P的5’端磷酸化；所述DNAzyme链第39和40位碱基之间包含双硫键；3’端修饰反向dT；所述报告探针H链5’端修饰荧光报告基团，第25位修饰荧光猝灭基团。该传感器检测限低，构建方法简单，性能稳定，工艺成本低，适用于产业化生产和检测的要求。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测miRNA和谷胱甘肽的荧光生物传感器。

背景技术

miRNA (small single-stranded, ss)是非蛋白质编码小RNA，通过与蛋白质编码基因的信息配对，在转录后水平上促进mRNA的切割或翻译抑制，在基因调控中发挥重要作用。miRNA调控细胞内的许多生物学行为，包括细胞分化、增殖、凋亡、耐药、血管生成、侵袭和转移等。miRNA是一种重要的生物分子，是正常组织器官中不可缺少的结构和功能元素之一。

谷胱甘肽(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。是一种哺乳动物体内含量较为丰富的含巯基的三肽类物质，具有抗氧化、清除自由基以及调控重要的细胞内的生理过程的能力。

目前，northern blotting是应用最广泛的miRNA检测方法。然而，基于杂交和印迹的northern blotting分析不适合大规模筛选目的。此外，该方法样品消耗、劳动密集、敏感性差，探针标记容易引起样品降解和环境污染。检测谷胱甘肽的方法有比色法、双光子发射法等，但它们都存在耗时、仪器昂贵、操作复杂等缺点。由于其无与伦比的灵敏度和特异性，实时定量PCR已成为各种核酸定量的高效检测工具，也被认为是miRNA谱分析的金标准方法。然而，这种方法无法量化活性成熟miRNA，并且需要昂贵的仪器和训练有素的专业操作人员。此外，设计用于miRNA检测的PCR引物也比较困难。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测miRNA和谷胱甘肽的荧光生物传感器，检测速度快、操作简单。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种联合检测miRNA155和谷胱甘肽的荧光生物传感器，包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的连接探针L、挂锁探针P、DNAzyme链（H1）和报告探针H，Mg²⁺、phi29 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTP；

所述挂锁探针P的5’端磷酸化；

所述DNAzyme链第39和40位碱基之间包含双硫键；3’端修饰反向dT。

所述报告探针H链5’端修饰荧光报告基团，第25位修饰荧光猝灭基团。

优选地，所述连接探针L、挂锁探针P和T4 DNA连接酶以环状模板代替。

所述环状模板的构建方法，包括：将挂锁探针P与连接探针L在T4 DNA连接酶缓冲液中杂交，然后加入T4 DNA连接酶低温下反应，然后灭活T4 DNA连接酶；纯化后得环形模板。

优选地，所述生物传感器还包括缓冲溶液；更为优选地，所述缓冲溶液中包含Mg²⁺。

一种包含上述荧光生物传感器的检测miRNA155的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括miRNA155的标准样品。

优选地，上述荧光生物传感器或试剂盒在miRNA155存在下，也可用于检测GSH的浓度。

一种采用上述生物传感器或者试剂盒检测miRNA155的方法，包括以下步骤：