[发明专利]猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用

权利要求书

1.一株猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，命名为猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018，该毒株于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202174。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018于2018年从山东省高密市PEDV阳性猪场病猪肠道采集分离所得。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，其S基因全长4158bp，属于GII-b基因亚型，相对于经典疫苗株CV777，氨基酸序列在58-59位有4个aa插入，135-136位有1个aa；在158位有2个aa缺失，1194位有1个缺失，所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018与GI型CV777毒株同源性为92.8%，与GII型HM2017同源性最高为98.3%。

4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，其分离鉴定方法，包括以下步骤：

病料处理：将经RT-PCR检测为PEDV阳性的具有腹泻症状的病仔猪的肠道内容物用DMEM制成悬液，涡旋震荡混匀，冻融一次后高速离心，取上清液过滤后得病毒悬液，冷冻备用；

分离筛选：将所得的病毒悬液接种到形成单层的Vero细胞培养层中，在培养箱中感作后弃去接种物，加入含有胰蛋白示磷酸肉汤及胰酶的DMEM培养基培养，每日观察细胞是否产生病变CPE，若无病变则于第5天收集培养液冻融一次后继续盲传；所得的病毒中命名为猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018的毒株传至第五代可见细胞产生明显的CPE，收集每代次病毒液应用qPCR试剂盒对病毒核酸拷贝数进行监测，结果发现随着代次升高，核酸拷贝数也随之升高；

鉴定：采用Western blot与间接免疫荧光法对分离所得猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018进行鉴定。

5.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，所述病料处理步骤包括：将经RT-PCR检测为PEDV阳性的具有腹泻症状的病仔猪的肠道内容物与DMEM按体积比1:5制成悬液，涡旋震荡混匀，-80℃冻融一次，4℃条件下 12000r/min离心30min，取上清液用0.22μm的滤器进行过滤后得病毒悬液，放入-80℃冰箱冷冻备用。

6.根据权利要求4所述的猪流行性腹泻病毒毒株，其特征在于，所述分离鉴定方法还包括蚀斑纯化步骤：在分离所得病毒传至第10代时进行毒株的蚀斑纯化，通过一次纯化获得性状相对一致的病毒粒子，作为猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018。

7.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备预防猪流行性腹泻病的灭活疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

增殖所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018，收获病毒液；

将病毒液加入灭活剂中进行灭活；

将灭活的病毒液与佐剂混合，乳化即得灭活疫苗。

9.根据权利要求8所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1）用Vero细胞增殖所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018，在增殖过程中，在病毒感染Vero细胞维持液中添加胰蛋白示磷酸胨肉汤。

10.权利要求8或9所述的制备方法制得的猪流行性腹泻病灭活疫苗。