[发明专利]猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用

说明书

本发明提出了猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用，该毒株命名为猪流行性腹泻病毒PEDV‑CH/GM2018，该毒株于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202174。该毒株为优化分离培养所得的流行PEDV变异株，能够在细胞上稳定传代，为有效的疫苗制备和猪流行性腹泻病防控提供了基础，利用该毒株制备灭活疫苗能对仔猪产生良好的保护作用。

技术领域

本发明属于病毒疫苗技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是目前在全球范围内广泛流行的冠状病毒。PEDV主要侵害各日龄猪，尤其可感染仔猪小肠，并迅速导致仔猪产生水样腹泻，伴随呕吐、脱水等临床症状，致其死亡率可达100%。成年猪不发生腹泻，但常伴有精神萎靡不振，食欲下降等症状。PEDV于1971年首次在英国发现。在我国，PEDV于1984年首次在猪小肠原代细胞中分离。在2010年以前，PEDV在我国猪场的感染情况具有散发和区域性特征，并未爆发大规模流行。2010年10月，在南方诸省开始出现PEDV的急性爆发并迅速蔓延至全国，即使接种了疫苗的哺乳仔猪也未能幸免。仔猪症状主要表现为黄色水样腹泻，体重下降，最后死于严重的脱水。经确认此次流行的毒株为变异毒株，应用荧光定量PCR检测各省平均的感染率为58.32% 。进一步实验表明，该毒株感染仔猪后具有PEDV的典型症状，3-5日龄哺乳仔猪2-3天后出现症状，死亡率为100%。随着灭活疫苗和二联弱毒疫苗的使用，PED疫情在我国得到了一定的控制。但毒株的变异导致其传染性急剧增加，给我国养猪业造成重大损失。

PEDV的病毒粒子呈多形性，在囊膜外表面排列类似“日冕”样，长约20 nm的纤突突起，直径95—190 nm。长度约为28kb，其基因组为单股正链RNA，包括 5′端帽和3′端多聚腺苷酸尾，从5′到3′端依次是Pol基因、S基因、ORF3基因、sM/E 基因、M基因和N基因。针对PEDVS基因序列可将 PEDV 分为 G1与 G2基因亚型。其中， G1型包含 PEDV 经典毒株 CV777 疫苗株，G2 型为PEDV流行毒株，由于毒株的突变而使得目前可用的疫苗对变异毒株未能完全保护。

另外，PEDV变异毒株在细胞上分离困难，并且在细胞上增殖获得病毒的毒价低，也是影响猪流行性腹泻疫苗的保护效果的重要原因。通常猪场利用反饲和制备组织灭活疫苗来预防该病的感染，反饲风险大，猪场制备的组织灭活疫苗杂蛋白多、每批苗批间差异较大，导致组织苗免疫后副反应大，保护效果不确实。

发明内容

本发明提供一株猪流行性腹泻病毒毒株、灭活疫苗及其应用，该毒株为优化分离培养所得的流行PEDV变异株，能够在细胞上稳定传代，为有效的疫苗制备和猪流行性腹泻病防控提供了基础，利用该毒株制备灭活疫苗能对仔猪产生良好的保护作用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明第一方面公开了一株猪流行性腹泻病毒毒株，命名为猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018，该毒株于2021年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO: V202174。

作为优选，所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018于2018年从山东省高密市PEDV阳性猪场病猪肠道采集分离所得。

作为优选，所述的猪流行性腹泻病毒毒株的S基因全长4158bp，属于GII-b基因亚型，相对于经典疫苗株CV777，氨基酸序列在58-59位有4个aa插入，135-136位有1个aa；在158位有2个aa缺失，1194位有1个缺失，所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018与GI型CV777毒株同源性为92.8%，与GII型AH2012同源性最高为98.3%。

作为优选，所述猪流行性腹泻病毒PEDV-CH/GM2018毒株为GII型现地流行毒株，其的分离鉴定方法，包括以下步骤：