[发明专利]一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1 ipsc细胞培养：将iPSC克隆在包被过Matrigel的培养皿中培养，待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基，然后进行洗涤、传代培养，37℃孵育3～5min；

S2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；

所述混合培养基为含有Chir99021和白术内酯Ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含B27添加剂、LAA2P的RPMI 1640培养基；

所述抑制剂培养基为含有Wnt-C59的基础培养基；

所述维持培养基为基础培养基。

2.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中，经过孵育培养后，还加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:4～1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被Matrigel，然后将细胞置于5％CO₂的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min。

3.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中，包被过Matrigel的培养皿为采用1:150～250稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜。

4.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中，采用无钙镁的PBS溶液洗涤。

5.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤S1中，使用0.5mmol/L EDTA传代培养，培养时轻轻摇动培养瓶，使EDTA铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉EDTA，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的EDTA呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。

6.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤S2中，混合培养基中，Chir99021的浓度为4.6～5.8μmol/L，白术内酯Ⅱ的浓度为5.3～6.3mol/L，所述基础培养基为含有2％的B27添加剂、64μg/L LAA2P的RPMI 1640培养基。

7.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述抑制剂培养基中，Wnt-C59的浓度为1～3μmol/L。

8.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述混合培养基的培养时间为48h，所述抑制剂培养基的培养时间为48h，所述维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。