[发明专利]一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法

说明书

本发明公开了一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，涉及生物技术领域。所述方法包括以下步骤：S1ipsc细胞培养；S2诱导ipsc分化为心肌细胞。使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞，所述混合培养基为含有Chir99021和白术内酯Ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含B27添加剂、LAA2P的RPMI 1640培养基；所述抑制剂培养基为含有Wnt‑C59的基础培养基；所述维持培养基为基础培养基。本发明诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，具有分化时间短(3天即可见分化出跳动的心肌细胞)，分化效率高(7天分化效率高达85％)的优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法。

背景技术

目前治疗心脏疾病的终末发展阶段—心力衰竭的最后手段仍为移植。然而，因供体资源严重短缺而导致很多患者在等待中死亡。iPSC-CM方法的出现为这一现状带来新希望，其主要长期目标是转变临床上从供体获得心肌组织治疗受损心脏这一现状。

胚胎早期心血管系统发育相关的基因调控网络是心肌分化的理论基础。近10年致力于干细胞心肌分化的研究多采用阶段特异性激活或抑制不同的信号通路，通过调控重现上述心肌发育的关键节点实现最终分化的目的。用于心肌分化的干细胞有两种培养方式，一种是形成 EB(embryoid body)球，一种是单层培养的多潜能干细。后者也有铺基质胶培养干细胞和通MEF 饲养层培养干细胞两种方法。早期的培养体系以KSR(knockout ser-umreplacement)作为基础培养体系，分化过程中添加BMP4，FGF2，Activin A等因子促进分化。随后，培养体系更换为 RPMI 1640和B27添加剂，并且简化培养体系将因子调控信号通路转换为小分子调控。培养体系逐渐向无动物源成分且成分明确、简单、高效的方向转变，这主要为临床心肌移植的最终目标打下基础。

然而，目前上述诱导ipsc分化为心肌细胞的方法分化时间长，分化效率仍然较低。

发明内容

本发明提供的一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：

一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

S1 ipsc细胞培养：将iPSC克隆在包被过Matrigel的培养皿中培养，待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基,然后进行洗涤、传代培养，37℃孵育3～5min；

S2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；

所述混合培养基为含有Chir99021和白术内酯Ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含B27 添加剂、LAA2P的RPMI 1640培养基；

所述抑制剂培养基为含有Wnt-C59的基础培养基；

所述维持培养基为基础培养基。

本发明中，所述步骤S1中，经过孵育培养后，还加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:4～1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1 小时，使培养板完全、均匀地包被Matrigel，然后将细胞置于5％CO₂的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min。

本发明中，所述步骤S1中，包被过Matrigel的培养皿为采用1：150～250稀释的matrigel 工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜。