[发明专利]一种利用糖基转移酶UGT76G1突变体高效生物合成莱鲍迪苷M的方法

说明书

本发明公开了一种利用糖基转移酶UGT76G1突变体高效生物合成莱鲍迪苷M的方法，属于酶工程成领域。本发明通过定向进化得到高催化活性突变体UGT76G1‑T284S/M88L/L200A。并将糖基转移酶突变体UGT76G1‑T284S/M88L/L200A与拟南芥来源的蔗糖合酶AtSuSy构建偶联反应，实现以莱鲍迪苷D为底物高效催化合成莱鲍迪苷M，通过补料添加底物Reb D以22.58g/L(20mM)Reb D为底物反应7h，高效合成23.37g/L的Reb M，Reb M产率达到90.5％，为Reb M的生产提供了一条高效且绿色的新途径。

技术领域

本发明涉及一种利用糖基转移酶UGT76G1突变体高效生物合成莱鲍迪苷M的方法，属于酶工程领域。

背景技术

由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷A(Reb A)等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖250-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的苦后味严重影响它们作为甜味剂的口感。而在甜菊糖苷中含量较少的莱鲍迪苷M(Reb M)相较于Reb A和甜菊糖具有更高的甜度，并且减少了甜味之外的后苦味，且甜味更快而因此作为甜味剂具有更好的口感，被认为是非常具有潜力的下一代甜味剂。其中，Reb M相较于RebD具有更高的商业价值。然而，Reb M在甜叶菊干叶中的含量仅为0.4％-0.5％，仅为Reb A含量的十分之一左右，这也使得通过传统的叶片提取Reb A的方法并不适用于Reb M的提取。繁琐且复杂的提取方法使得仅从甜叶菊叶子中提取难以实现规模化生产，也难以满足市场需求。

目前，通过相关科学家不断探索和挖掘，通过酶催化方法利用Reb D合成Reb M被认为是一种可行的提高Reb M生产量的技术路线。然而，负责催化Reb D合成Reb M糖基转移酶UGT76G1存在酶活低、异源表达水平低和催化过程中催化Reb A生成副产物Reb I等缺点，因此UGT76G1成为酶催化方法合成Reb M过程中关键的限速步骤，使其难以实现规模化生产以满足市场需求。目前，已有文献报道通过融合表达提高UGT76G1异源表达水平，酶固定化方法提高酶UGT76G1的稳定性和催化效率，以及通过定点突变获得活性提高的突变体UGT76G1-T284S并且减少了副产物Reb I的生成。然而这些方法不足以使UGT76G1具有足够的酶活满足规模化生产Reb M的要求。因此，通过基于蛋白质晶体结构的定向进化改造UGT76G1提高其活性以满足Reb M的规模化生产具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过对糖基转移酶UGT76G1进行基于蛋白质晶体结构的定向进化，成功获得高效突变体，并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖UDPG循环体系，利用体外纯酶反应体系实现高效生物合成Reb M，为Reb M生物合成提供一种新的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶UGT76G1突变体，为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸序列并且具有催化Reb D为Reb M的酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供表达上述糖基转移酶UGT76G1突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带上述糖基转移酶UGT76G1突变体的基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述糖基转移酶UGT76G1突变体的重组菌。

在一种实施方式中，所述重组菌还可以表达蔗糖合酶。