[发明专利]一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌在基因组上敲除了色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA，含有具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒和表达目的蛋白的重组质粒；

所述具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒含有SPP型启动子、低温诱导型启动子P_R、高温诱导型启动子P_L、色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA、操纵区trpO、D,D-羧肽酶基因dacA和温敏阻遏蛋白CI^ts857；所述操纵区trpO具有可与由阻遏蛋白trpR和色氨酸形成的共价二聚体结合的结合位点；所述启动子P_L上具有温敏阻遏蛋白CI^ts857的结合位点；所述启动子P_L调控trpEDCBA的表达；所述启动子P_R调控温敏阻遏蛋白CI^ts857的表达；所述SPP型启动子调控操纵区trpO的基因表达；所述操纵区trpO的下游具有dacA基因；所述启动子P_L和启动子P_R的转录方向相反；

所述表达目的蛋白的重组质粒上含有编码目的蛋白的基因。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，启动子P_L的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；启动子P_R的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；编码所述启动子SPP的核苷酸序列如SEQ ID No.7～11任一所示；操纵区trpO的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；编码所述温敏阻遏蛋白CI^ts857的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述D,D-羧肽酶基因dacA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述dacA基因的上游还含有trpL碱基序列；所述trpL碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌可选自：E.coli BL21、E.coliJM109、E.coli DH5α、E.coli Rosetta、E.coli TOP10、E.coliM110、E.coliS110中的任一种。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述目的基因为羟基类固醇脱氢酶基因。

6.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述目的基因为胺脱氢酶基因。

7.一种调控大肠杆菌全细胞催化的方法，其特征在于，以权利要求1～6任一所述的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，抑制DacA蛋白表达，促进各类酶类在胞内积累；第13～36h控制温度为20～24℃，促进DacA蛋白表达，从而提高大肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性，促进全细胞催化；第37h加入底物，于28～32℃继续反应至少36h。

8.一种全细胞生产α-手性胺的方法，其特征在于，以权利要求6所述的重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，第13～36h控制温度为20～24℃，第37h加入底物苄基丙酮，于28～32℃继续反应至少36h生产α-手性胺。

9.一种全细胞生产7-氧代-石胆酸的方法，其特征在于，所述全细胞催化方法是以权利要求5所述大肠杆菌作为全细胞催化剂，在发酵前12h控制发酵温度为36～38℃，第13～36h控制温度为20～24℃，第37h加入底物鹅去氧胆酸，于28～32℃继续反应至少36h生产7-氧代-石胆酸。

10.权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌在食品、生物领域全细胞催化生产生物产品中的应用。