[发明专利]一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用

说明书

本发明公开了一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。本发明通过构建色氨酸操纵子及温敏阻遏系统，可实现大肠杆菌生长前期稳定、正常生长，稳定期促进目的蛋白的表达；该系统还通过控制发酵温度，调节结构基因的表达水平，调控D,D‑羧肽酶实时表达量，增加了胞内可溶性肽聚糖，提高了重组大肠杆菌外膜的透性，有助于催化反应的底物及产物自由穿梭于细胞内外，更加有效的促进全细胞的高效催化。

技术领域

本发明涉及一种精准定量调控大肠杆菌全细胞催化的方法及应用，属于基因工程与生物催化领域。

背景技术

大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。大肠杆菌在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。是常用的重组蛋白高效生产的宿主之一，但是在大肠杆菌的异源表达中，大部分重组蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造成阻碍。

肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均密切相关。

手性纯胺是当前药物生产中重要的前体物质，α-手性胺约占目前单一对映体商品化的旋光药物的40％。这些胺当前主要的生产方式是通过预先形成的N-取代亚胺等的不对称氢化而合成的。然而，这种策略缺乏效率，因为需要多个化学步骤。尽管近年来在有机金属催化(例如，使用铱、钌或钯催化剂)和有机催化中，含羰基化合物的不对称还原胺化已取得了重大进展，但许多酶促途径提供了更高效的原子效率方法，特别是用于合成对映体纯净形式的活性药物成分(API)。胺脱氢酶(AmDHs)能够催化酮的不对称还原胺化反应，且反应的副产物仅有水，无需担心痕量有毒重金属的存在，这使它在手性胺的酶催化合成中受到了广泛关注。大多数的野生型胺脱氢酶由于对酮类及羰基底物的还原胺化活性均不高，其酶结构并未得到测定。Ye等人以红球菌属的苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)为起点，根据对酶结构特点的研究，最终构建了两种具有高催化活性的胺脱氢酶，K66Q/N262C(DM_pheDH)以及K66Q/S149G/N262C(TM_pheDH)，该酶为当前酮的不对称还原胺化中一种催化活性较高的胺脱氢酶。(R)-1-甲基-3-苯丙胺是生产治疗高血压药物拉贝洛尔、地瓦洛尔等的中间体，是药物化学中重要的中间体成分。其当前主要的工业生产方式及实验室制备是通过水解酶进行动力学拆分或通过单胺氧化酶进行脱硝，使用外消旋体生产手性纯胺。但其理论上的最大产出率仅为50％。

胆汁酸是饱和羟基化的C-24环戊烷菲甾醇，在调节葡萄糖、脂质、能量代谢、肠道免疫和肠道炎症中发挥重要作用。7-氧代-石胆酸(7-oxolithocholic acid，7-oxo-LCA)是合成熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)的重要前体。熊去氧胆酸用于临床治疗人类胆固醇胆结石，也是FDA批准治疗原发性胆汁酸肝硬化的药物。UDCA的传统化学合成涉及酯化、氧化、脱保护等一系列化学过程，过程效率低、成本高、并伴随多种副产品产生，环境严重污染。因此，开发新型绿色高效制备UDCA及其前体的方法具有重要意义。羟基类固醇脱氢酶(HSDH)在胆汁酸类物质转化、甾体激素转化、胆固醇代谢、非甾体类醛、酮和醌羰基还原过程中发挥重要作用。7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH，EC1.1.1.159)是合成UDCA的前体7-oxo-LCA的主要酶之一。它是含有罗斯曼折叠NAD(P)H/NAD(P)+结合域的短链脱氢酶/还原酶。大多为同源二聚体或四聚体，在单体的N端和C端具有辅因子和底物结合催化区域。

发明内容

一种重组大肠杆菌胞，所述重组大肠杆菌在基因组上敲除了SEQ ID NO.1所示的色氨酸合成酶基因簇trpEDCBA，含有具有温度诱导和受色氨酸调控的重组质粒和表达目的蛋白的重组质粒；